[发明专利]一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析

权利要求书

1.一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据银杏转录组数据库筛选出两个参与类黄酮合成的IncRNA，分别命名为Inc10和Inc11；

(2)克隆Inc10和Inc11基因；

(3)qRT-PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量；

(4)构建Inc10和Inc11过表达载体。

2.根据权利要求1所述的一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，步骤(2)中所述的Inc10和Inc11基因的克隆包括以下步骤：

1)分别采集新鲜的银杏根、茎、幼嫩叶、成熟叶、雄球花、雌球花、果实七个独立样本，将采集的材料迅速冻于液氮中，保存于-80℃冰箱中备用；

2)参照RNA提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit说明书进行RNA的提取；

3)参照RNA反转录试剂盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RNA反转录；

4)以cDNA为模板，利用2×Rapid Taq Master Mix扩增lncRNA。

3.根据权利要求1所述的一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，步骤(3)中所述的qRT-PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量，具体为：以根、茎、叶、雄球花、雌球花和果实中7个组织的cDNA为模板，选取银杏GbNADPH作为内参基因，利用IDT在线网站设计特异性定量引物，进行实时定量PCR扩增。

4.根据权利要求1所述的一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，步骤(4)中所述的Inc10和Inc11过表达载体的构建，包括如下步骤：

1)对pBI121-GUS选用Xba I和Xma I进行双酶切，37℃酶切1h，65℃水浴20min，使酶失活；

2)采用电泳检测上述酶切产物，并检测产物浓度。根据II One StepCloning Kit说明书，按照载体与插入片段摩尔比为1:2的比例进行重组反应，37℃反应30min，将重组产物通过的热激法转入到DH5α并进行阳性验证和测序。

5.一种银杏类黄酮合成IncRNA的功能分析，其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过农杆菌介导转化拟南芥，获得转基因拟南芥植株；

(2)HPLC检测转基因和对照组拟南芥中类黄酮含量；

(3)拟南芥总RNA提取；

(4)野生型和转基因拟南芥转录组文库构建及测序；

(5)RNA-seq分析，查找IncRNA和类黄酮代谢差异表达基因；

(6)qRT-PCR检测转基因和对照组拟南芥中的差异表达基因，利用qRT-PCR技术对转录组数据进行验证；

(8)RNA Pull-down

通过RNA pull-down技术获得与lnc10互作蛋白，然后进行质谱分析。