[发明专利]一种新型环状RNA成环序列构建CAR-T细胞及在治疗小细胞肺癌中的应用

说明书

本发明公开了新型环状RNA成环序列构建CAR‑T细胞及在治疗小细胞肺癌中的应用。本发明提供了一种制备DLL3‑CAR‑T细胞的方法，包括如下步骤：1)制备DLL3‑CAR结构环状RNA；2)将所述DLL3环状RNA包载在脂质材料中，得到包载DLL3circRNA的LNP；3)将所述包载DLL3circRNA的LNP转染到T细胞中，得到DLL3‑CAR‑T细胞。本发明实验证明，本发明提供了一种新型RNA成环序列及其构建CAR‑T细胞的制备方法，利用该方法构建靶向DLL3靶点的CAR‑T，有望为SCLC治疗提供一种创新、有效的治疗技术，为CAR‑T应用于肿瘤治疗带来革命性的突破。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型环状RNA成环序列构建CAR-T细胞及在治疗小细胞肺癌中的应用。

背景技术

δ样配体(Delta-Like Ligand 3，DLL3)是一种在小细胞肺癌(small cell lungcancer,SCLC)等肿瘤细胞表面高表达的单次跨膜蛋白，属于Notch配体家族中的一员。DLL3通过与Notch受体结合，抑制Notch信号通路轴，增强SCLC细胞的增殖、克隆、侵袭，从而促进SCLC进展。鉴于DLL3在SCLC细胞中高表达，在正常组织中无或低表达，这为靶向治疗提供巨大潜力。

嵌合抗原受体T细胞疗法(chimeric antigen receptor T cell therapy,CAR-T)即通过基因工程技术，改造T细胞使其激活并装配一个靶向肿瘤细胞的受体，在大量扩增后重新输注回病人体内，以达到杀伤肿瘤的一种免疫疗法。但现阶段个性化CAR-T制备价格昂贵，时间成本高，且患者在治疗过程中可能面临“清淋”等风险。2022年初，science杂志报道了首例利用信使RNA(mRNA)进行体内CAR-T改造的研究。该团队利用脂质纳米粒(lipidnanoparticle,LNP)递送mRNA至T细胞，使T细胞表达特异性靶向成纤维细胞激活蛋白的CAR结构，并特异性富集到心脏部位，以达到逆转受损心肌纤维化、修复心脏损伤的目的。然而，目前尚未有体内编辑CAR-T细胞进行肿瘤治疗的临床研究。

环状RNA(circRNA)是一类具有闭合环状结构的单链RNA分子。与mRNA相比，circRNA合成工艺更简单(不需要加帽加尾)、稳定性更好(环状结构对核酸外切酶更耐受)、蛋白翻译量和持续时间更长。因此，circRNA有望成为mRNA技术的2.0版本。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型RNA成环序列及其构建CAR-T细胞的制备方法。

第一方面，本发明提供了一种制备靶向DLL3靶点的CAR-T细胞(后简称为DLL3-CAR-T)的方法，包括如下步骤：

1)制备靶向DLL3 CAR结构(后简称为DLL3-CAR)的环状RNA，记作DLL3 circRNA；

所述DLL3 circRNA按照如下方法制备：

1)-1、制备表达DLL3 circRNA的质粒，该质粒含有DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段；

上述表达DLL3 circRNA的质粒具体委托公司合成，在本发明的实施例中具体为pUC57-DLL3，具体为将DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架克隆至pUC57质粒载体得到；

所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段依次包括：5’同源臂、鱼腥藻T4内含子3’端、CVB3_IRES_1、DLL3-CAR结构编码序列、CVB3_IRES_2、鱼腥藻T4内含子5’端和3’同源臂；

所述CVB3_IRES_1的核苷酸序列为序列2第185-934位；

所述CVB3_IRES_2的核苷酸序列为序列2第2528-2570位；