[发明专利]一种新型环状RNA成环序列构建CAR-T细胞及在治疗小细胞肺癌中的应用

权利要求书

1.一种制备靶向DLL3靶点的CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：

1)制备靶向DLL3 CAR结构的环状RNA，记作DLL3 circRNA；

所述DLL3 circRNA按照如下方法制备：

1)-1、制备表达DLL3 circRNA的质粒，该质粒含有DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段；

所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段依次包括：5’同源臂、鱼腥藻T4内含子3’端、CVB3_IRES_1、DLL3-CAR结构编码序列、CVB3_IRES_2、鱼腥藻T4内含子5’端和3’同源臂；

所述CVB3_IRES_1的核苷酸序列为序列2第185-934位；

所述CVB3_IRES_2的核苷酸序列为序列2第2528-2570位；

1)-2、将所述表达DLL3 circRNA的质粒线性化，得到线性化质粒；

所述线性化采用酶的酶切位点存在于所述质粒中DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段除外的区域；

1)-3、从所述线性化质粒中扩增所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段，得到I型内含子核酶序列骨架片段扩增产物；

1)-4、体外转录所述I型内含子核酶序列骨架片段扩增产物，得到转录产物；

1)-5、向所述转录产物中添加GTP孵育，实现环化，得到DLL3 circRNA；

2)将所述DLL3 circRNA包载在脂质材料中，得到包载DLL3 circRNA的LNP；

3)将所述包载DLL3 circRNA的LNP转染到T细胞中，得到DLL3-CAR-T细胞，即为靶向DLL3靶点的CAR-T细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段中的5’同源臂上游还包括转录启动子；

或，所述5’同源臂的核苷酸序列为序列2第24-53位；

或，所述鱼腥藻T4内含子3’端的核苷酸序列为序列2第54-184位；

或，所述外源基因的核苷酸序列替换序列2第935-2527位所在位置；

或，所述鱼腥藻T4内含子5’端的核苷酸序列为序列2第2571-2686位；

或，所述3’同源臂的核苷酸序列为序列2第2687-2721位；

或，所述转录启动子为T7启动子；

或，所述T7启动子的核苷酸序列为序列2第1-23位。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段的核苷酸序列为序列2。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述T细胞为CD3+T细胞。

5.由权利要求1-4任一所述方法制备的DLL3-CAR-T。

6.如下任一所述物质：

A1)权利要求1-4任一中所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段；

A2)权利要求1-4任一中所述表达DLL3 circRNA的质粒。

7.如下任一所述物质在制备的DLL3-CAR-T中的应用；

B1)、权利要求1-4任一中所述DLL3-CAR结构编码序列的I型内含子核酶序列骨架片段；

B2)、权利要求1-4任一中所述表达DLL3 circRNA的质粒；

B3)、权利要求1-4任一中所述表达DLL3 circRNA的质粒、所述线性化采用的酶、所述扩增采用的引物、所述体外转录所需仪器或试剂、所述GTP和所述脂质材料。

8.权利要求5所述的DLL3-CAR-T或权利要求7中所述的物质在制备治疗肺小细胞癌或杀伤肺小细胞癌产品中的应用。

9.一种治疗肺小细胞癌或杀伤肺小细胞癌产品，其包括权利要求5所述的DLL3-CAR-T或权利要求7中所述的物质。