[发明专利]一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法

说明书

本发明涉及药物合成领域，公开了一种一锅酶法制备L‑5‑MTHF的方法。本发明提供方法通过往叶酸中加入二氢叶酸还原酶、四氢叶酸甲基转移酶，使叶酸在二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化下，发生不对称加氢反应，得到中间体化合物L‑四氢叶酸，后经四氢叶酸甲基转移酶(DmdA)催化得到具有光学纯的L‑5‑MTHF。本发明一锅酶法可以避免中间产物分离的步骤，同时，产生的中间体现时转化为产物L‑5‑MTHF，即产即用，避免了产物抑制的问题。本发明方法制备L‑5‑MTHF具有高产率，有极大的应用价值和市场前景。

技术领域

本发明涉及药物合成领域，尤其涉及一种一锅酶法制备L-5-MTHF的方法。

背景技术

L-5-甲基四氢叶酸(L-5-MTHF)是食物源天然叶酸的主要形式，也是人体血浆和血液循环中发现的唯一叶酸形式，被用于组织间的叶酸转运。L-5-MTHF可在体内循环中直接被吸收和利用，不需要额外的代谢步骤，比合成叶酸具有更高的生物利用度。此外，最近的研究表明，L-5-MTHF是唯一可以渗透通过血脑屏障的叶酸类药物，具有防治阿尔茨海默病的作用，同时也可以作为广谱抗肿瘤药甲氨蝶呤的解毒剂。所以，L-5-MTHF是最具生物活性和功能的叶酸形式。美国、日本和欧洲已经批准将L-5-MTHF作为一种食品添加剂添加到各种食品中，这也使得L-5-MTHF的市场需求量剧增。

L-5-MTHF含有两个手性碳原子，特别是C5和C6之间的双键加氢时，容易形成旋光异构体，包括6R-5-MTHF(即D-5-MTHF)和6S-5-MTHF(即L-5-MTHF)。其中(6S)构型的L-5-MTHF是自然存在的唯一形式，具有良好的药效，而6R构型的D-5-MTHF不能被人体吸收利用，无治疗保健作用。

L-5-MTHF的合成主要以叶酸为前体，包括化学法、酶-化学法、微生物发酵法等。

化学合成方法是现有工业生产中合成L-5-MTHF使用较为普遍的方法。化学合成方法有催化加氢法、硼氢化钠还原法、连二亚硫酸钠还原法和二氢叶酸还原酶法等。如硼氢化钠还原法，该方法使用NaBH₄作为还原剂，将叶酸还原生成THF消旋体混合物，然后分离进行甲基化获得L-5-MTHF。硼氢化钠还原法具有的缺点是：①NaBH₄具有强烈刺激性，极易燃烧，有安全隐患；②产物是外消旋混合物，分离困难；③生产步骤较多，生产较烦琐。

再如申请公布号为CN114874216A的中国专利提供了一种L-5-甲基四氢叶酸的制备方法，也是通过化学法合成L-5-MTHF。该专利合成L-5-甲基四氢叶酸的技术方案为：以叶酸为原料，还原制得中间体6-(R,S)-四氢叶酸；然后将6-(R,S)-四氢叶酸经过手性拆分，制得中间体6-S-四氢叶酸盐；最后将中间体6-S-四氢叶酸盐在缓冲液中经过甲基化反应制得L-5-甲基四氢叶酸。该专利提供方法将手性拆分提前在第二步，但仍然无法避免颇具难度的手性拆分步骤，另外，该方法步骤也较为繁杂，在工业应用中生产成本较高。

现有技术中，也有通过微生物发酵法制备L-5-MTHF。该方法是依赖于能够在胞内积累较高浓度的叶酸和L-5-MTHF的微生物，通过发酵制备获得L-5-MTHF。一般通过自然界筛选、诱变育种和基因工程育种等方法获得高产菌株。但是，由于叶酸类化合物属于胞内代谢的辅酶因子，存在多重的动态平衡调节，所以，其胞内积累的浓度十分有限。已有报道的微生物菌株以及经过基因组改造的菌株，发酵生产L-5-MTHF的水平都低于1.3mg/L。

现有技术中，还有通过酶法和化学法结合的方式制备L-5-MTHF。酶-化学法是依赖二氢叶酸还原酶(DHFR)法的活性，将二氢叶酸(DHF)还原成6S构型的四氢叶酸(6S-THF)，随后采用化学法进行转甲基反应。但在酶催化体系中，首先存在的问题是DHFR的活性受到产物6S-THF的抑制调节，其转化率受到一定限制，其次，6S-THF稳定性差，极易造成损失，若再进一步分离提取用于下一步的化学法甲基化反应，其产物得率低。