[发明专利]一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具及应用

说明书

本发明涉及一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具及应用。该定点基因插入工具由融合TniQ的dCas9蛋白、TnsB蛋白、TnsC蛋白、sgRNA、供体DNA构成；表达sgRNA的DNA由scaffold序列和spacer序列组成；供体DNA由LE序列、目的基因序列、RE序列构成。其应用为在原核生物细胞中定点插入目的基因。本发明针对原核生物细胞，利用融合TniQ的dcas9蛋白能精准地将长片段目的基因定点插入靶标基因位点，尤其适用于改造菌株性能(如大肠杆菌)。

技术领域

本发明涉及一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具及应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

基因插入技术是补偿基因缺失或失活而实现精准治疗的潜在治疗策略，同时也是改造菌株、植物等获得新功能的重要手段^[1-2]。目前常用的基因插入工具主要包括病毒、重组酶、转座酶、核酸酶等。然而，这些基因插入工具都存在一定的缺陷而限制了其应用。其中，病毒类工具插入位点随机，影响宿主正常代谢功能导致细胞坏死甚至诱发癌变^[3]；以Flp-FRT系统为代表的重组酶插入效率较低且受插入片段大小限制^[4]；CRISPR-Cas系统核酸酶、锌指核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶等介导的基因插入需要引入一段含有同源臂的供体DNA 作为模板，并依赖于同源重组，受制于细胞分裂状态而效率较低，且由核酸酶导致的双链断裂可能会存在染色体大片段缺失的风险，导致基因组的不稳定^[5-7]。转座酶类工具插入效率高但绝大部分为随机插入，如睡美人转座子、Marina和Tn5^[8-10]等，而Tn7转座子虽能定点插入，但插入位点仅限于attTn7位点，不利于广泛应用^[11]。

近年来，涌现了一系列以融合dCas9为基础的分子工具，如融合转录激活因子或阻遏蛋白以实现CRISPRa或CRISPRi^[12-15]，融合去甲基化酶探究新的增强子元件在胚胎干细胞期对基因的调控作用^[16]，以及融合脱氨酶的单碱基编辑工具^[17]等，充分发挥了dCas9-sgRNA的定点作用，将效应蛋白的作用更加定点化。此外，基于同源重组原理的基因插入很大程度受制于插入基因的长度，人们尝试将dCas9和具有高效整合性的转座酶或整合酶进行融合，以期改善转座子的随机插入作用而发挥定点转座的活性。Himar1转座子属于Tc1/mariner-family转座子家族，以同源二聚体的形式发挥活性，不需要任何其他宿主因子即可将7kb的片段在体外、细菌及真核细胞中进行转座，但其插入位置随机，位于TA双碱基区^[18-20]。实验发现，Himar1-dCas9融合蛋白在一对sgRNA的引导下能发生定点整合，两条sgRNA位置需间隔合适距离，太近会产生空间位阻而太远无法发挥转座酶活性。同时，转座效率也受融合蛋白、靶向DNA、供体DNA浓度影响。但该系统目前仅在大肠杆菌中进行验证，且插入TA 位置的活性比单独的转座酶强300倍，相较而言仍具有较高的脱靶性，有待进一步优化。dcas9融合睡美人转座子虽能提高转座子的靶向性，但插入位点集中在TA双碱基位点，且位于Protospacer Adjacent Motif(PAM)下游300bp范围内，靶向性仍不高有待进一步优化^[21]。