[发明专利]一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具及应用

权利要求书

1.一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具，其特征是，由融合TniQ的dCas9蛋白、TnsB蛋白、TnsC蛋白、sgRNA、供体DNA构成；所述融合TniQ的dCas9蛋白由dCas9蛋白的N端经linker多肽与TniQ蛋白连接而成，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述TniQ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述linker多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14之一；所述TnsB蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.8；所述TnsC蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.10；

表达sgRNA的DNA由scaffold序列和spacer序列组成，其中，scaffold序列为：5'-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt-3'，spacer序列根据靶标基因设计而成；

所述供体DNA由LE序列、目的基因序列、RE序列构成，其中，LE序列为：5'-ttagacatctccacaaaaggcgtagtgtacagtgacaaattatctgtcgtcggtgacagattaatgtcattgtgactatttaattgtcgtcgtga cccatcagcgttgcttaattaattgatgacaaattaaatgtcatcaatataatatgctctgcaattattatacaaagcaattaaaacaagcggataa aaggacttgctttcaacccacccctaagtttaatagttactga-3'，RE序列为：5'-gcgacagtcaatttgtcattatgaaaatacac aaaagctttttcctatcttgcaaagcgacagctaatttgtcacaatcacggacaacgacatctattttgtcactgcaaagaggttatgctaaaact gccaaagcgctataatctatactgtataaggattttactgatgacaataatttgtcacaacgacatataattagtcactgtacacgtagagacgta gcaatgctacctc-3'，目的基因序列为待插入的基因序列。

2.根据权利要求1所述的一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具，其特征是，所述表达sgRNA 的DNA的结构为5'-scaffold序列-spacer序列-3'；所述供体DNA的结构为5'-LE序列-目的基因序列-RE序列-3'。

3.根据权利要求1所述的一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具，其特征是，所述linker的氨基酸序列为SEQ ID NO.6。

4.根据权利要求1所述的一种基于ShCAST系统的定点基因插入工具，其特征是，所述dCas9蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.1，所述TniQ蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.3，所述linker多肽的编码基因序列选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.13之一；所述TnsB蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.7；所述TnsC蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.9。

5.一种定点基因插入方法，其特征是，采用权利要求1至4任一项所述基于ShCAST系统的定点基因插入工具；

所述定点基因插入方法包括以下步骤：

第一步、针对靶标基因设计表达sgRNA 的DNA中的spacer序列；并确定供体DNA中的目的基因；

第二步、将融合TniQ的dCas9蛋白的编码基因序列、TnsB蛋白的编码基因序列、TnsC蛋白的编码基因序列、表达sgRNA的DNA、供体DNA分别构建入质粒；

第三步、将第二步所得质粒共转入E.coli原核表达细胞，利用含有抗生素的培养基的平板进行筛选，将筛选所得菌体进行诱导表达，促使基因发生定点转座，从而将目的基因插入靶标基因位点。