[发明专利]一种高羊茅高效快速的遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，包括(1)高羊茅外植体消毒、脱皮；(2)不依赖基因型的愈伤组织诱导；(3)农杆菌转化；(4)阳性愈伤筛选和再生；(5)再生苗生根、壮苗和移栽。本发明属于牧草和草坪草基因工程技术领域，具体是指一种高效快速、无基因型限制高羊茅高效快速的遗传转化方法；本发明以高羊茅种子为外植体，使用7.0mg·L‑1 2,4‑D联合50％硫酸在50℃条件下进行处理，从而消除了基因型对高羊茅遗传转化的影响，扩大了遗传转化方法的适用性，本发明的遗传转化方法转化效率高，适用于现有多数商业品种，且本发明遗传转化步骤少，节约了转化时间，培养基配比简单，易于操作，有利于快速获得阳性转基因高羊茅植株。

技术领域

本发明属于牧草和草坪草基因工程技术领域，具体是指一种高羊茅高效快速的遗传转化方法。

背景技术

高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)是禾本科牧草和草坪草两用型禾草，耐干旱，耐粗放管理，适应性广，正成为我国使用量增长最快的草种，在我国西部、北部及长江流域气候过渡区广泛种植应用。然而，现有高羊茅遗传转化效率低、严重依赖基因型，转化周期长，一般需要6个月以上，严重制约了高羊茅基因功能研究，分子育种进程。

针对目前高羊茅遗传转化周期长、效率低、受基因型限制、所用激素多、耗费大、污染重等问题，本发明提供一种高效快速的高羊茅遗传转化方法。

发明内容

1.1基本思路

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种高效快速、无基因型限制高羊茅高效快速的遗传转化方法，该方法是将高羊茅种子为外植体，使用7.0mg·L^-1 2,4-D联合50％硫酸在50℃条件下进行处理，从而消除了基因型对高羊茅遗传转化的影响，扩大了遗传转化方法的适用性；本发明添加的乙酰丁香酮与梅叶片提取物可以协同稳定高羊茅的愈伤分化；同时，在本发明中，愈伤分化前培养基只添加2,4-D和6-AB，愈伤分化用6-AB和NAA，整个遗传转化过程减少了激素种类，诱导愈伤后直接转化不继代，转化后直接在40mg·L^-1潮霉素TF-5培养基上进行筛选，省去了传统在无潮霉素培养基上预培养的过程，提高遗传转化效率，简化了操作流程，有利于快速获得阳性转基因高羊茅植株。

1.2具体方案

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，所述遗传转化方法包括如下步骤：

(1)高羊茅外植体消毒、脱皮

以高羊茅种子为外植体，使用纯水配置的7.0mg·L^-1 2,4-D浸泡16-20h，然后使用50％(v/v)硫酸在搅拌速度为180rpm、温度为50℃的条件下消毒25min，无菌水清洗5-7次；

在无菌环境中使用75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗3次，再用50％(v/v)84消毒液在搅拌速度为180rpm的条件下消毒25min，无菌水清洗5-7次，倒去多余无菌水即为脱皮后的高羊茅外植体，此消毒步骤相对简单，无有毒化学药品，对人体环境伤害少；

(2)不依赖基因型的愈伤组织诱导

纵切高羊茅外植体，所述切割后的高羊茅外植体含胚组织，然后将切割后的高羊茅外植体按1cm间距均匀放置在TF-1培养基上，于25℃进行暗培养获得高羊茅愈伤组织；

(3)农杆菌转化

活化培养：当步骤(2)中所述高羊茅愈伤组织直径达到0.5-1cm，将愈伤切成体积为0.2×0.2×0.2cm的愈伤组织颗粒，均匀的放置在TF-3培养基上，进行暗活化培养18h得到活化高羊茅愈伤组织，将活化高羊茅愈伤组织在TF-2培养基上继代培养7-28d或进行农杆菌转化；