[发明专利]一种高羊茅高效快速的遗传转化方法

权利要求书

1.一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述遗传转化方法包括如下步骤：

(1)高羊茅外植体消毒、脱皮

以高羊茅种子为外植体，使用纯水配置的7.0mg·L^-1 2,4-D浸泡16-20h，然后使用50％(v/v)硫酸在搅拌速度为180rpm、温度为50℃的条件下消毒25min，无菌水清洗5-7次；在无菌环境中使用75％的酒精浸泡2min，无菌水清洗3次，再用50％(v/v)84消毒液在搅拌速度为180rpm的条件下消毒25min，无菌水清洗5-7次，倒去多余无菌水即为脱皮后的高羊茅外植体；

(2)不依赖基因型的愈伤组织诱导

纵切高羊茅外植体，切割后的所述高羊茅外植体含胚组织，然后将切割后的高羊茅外植体按1cm间距均匀放置在TF-1培养基上，于25℃进行暗培养获得高羊茅愈伤组织；

(3)农杆菌转化

活化培养：当步骤(2)中所述高羊茅愈伤组织直径达到0.5-1cm，将愈伤切成体积为0.2×0.2×0.2cm的愈伤组织颗粒，均匀的放置在TF-3培养基上，进行暗活化培养18h得到活化高羊茅愈伤组织，将活化高羊茅愈伤组织在TF-2培养基上继代培养7-28d或进行农杆菌转化；

所述农杆菌转化为将活化高羊茅愈伤组织浸泡在活化后OD600为0.3-0.5的农杆菌的转化液中，25℃抽真空5min，搅拌速度为220rpm，温度为28℃共培养30min，使用无菌纸上吸去多余的转化液后将所述活化高羊茅愈伤组织转移至铺有滤纸的TF-4培养基上暗培养2-3d得到高羊茅共培养愈伤组织，所述滤纸使用转化液浸泡；

所述农杆菌的菌株为EHA105或者AGL1中的一种；

(4)阳性愈伤筛选和再生

将步骤(3)中所述高羊茅共培养愈伤组织使用含300mg/L头孢的无菌水洗涤3-4次，再于28℃摇床晃动浸泡30分钟，最后使用无菌水清洗3-4次，晾干2小时；转接到TF-5培养基上，于25℃暗培养30-45d得到未褐化且生长的阳性愈伤，将所述阳性愈伤转移到TF-6培养基上，于25℃、光照为14h、黑暗为10h的条件下分化培养28d-32d得到高羊茅分化组织；

(5)再生苗生根、壮苗和移栽

待高羊茅分化组织的叶片生长为2-3cm时转移到TF-7培养基上，进行生根培养28-32d；将去除培养基的根浸泡在自来水中，练苗7-10d，然后移栽到湿润的有机质中。

2.根据权利要求1所述的一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述TF-1培养基在N6培养基的基础上添加如下组分及浓度：1-1.5g·L^-1酸水解络蛋白；1.0-1.5g·L^-1脯氨酸；30-35g·L^-1麦芽糖；7.0-8.0mg·L^-1 2,4-D；0.05-0.08mg·L^-1 6-AB；3.5-4.0g·L^-1植物凝胶，所述TF-1培养基pH为5.8-5.9。

3.根据权利要求2所述的一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述TF-2培养基在N6培养基的基础上添加如下组分及浓度：1-1.5g·L^-1酸水解络蛋白；1-1.5g·L^-1脯氨酸；30-35g·L^-1麦芽糖；5.0-8.5mg·L^-1 2,4-D；0.1-0.2mg·L^-1 6-AB；3.5-4.5g·L^-1植物凝胶，所述TF-2培养基的pH为5.8-5.9。

4.根据权利要求3所述的一种高羊茅高效快速的遗传转化方法，其特征在于：所述TF-3培养基在二分之一的N6培养基的基础上添加如下组分及浓度：1.0-1.5g·L^-1脯氨酸；30-35g·L^-1葡萄糖；5.0-6.0mg·L^-1 2,4-D；0.1-0.5mg·L^-1 6-AB；200-300μmg·L^-1乙酰丁香酮；3.5-4.0g·L^-1植物凝胶，所述TF-3培养基的pH为5.4。