[发明专利]一种脐带间充质干细胞提取冻干粉及制备方法

说明书

本发明提供了一种脐带间充质干细胞提取冻干粉及制备方法。采用本发明的细胞冻存液制备的脐带间充质干细胞冻干粉的水化复苏率可达到96.5％，并且本发明的细胞冻存液之间也存在协同增效的技术效果，尤其是联合海藻糖、脱脂乳和葡聚糖的组合。采用本发明的细胞冻存液制备的脐带间充质干细胞冻干粉能有效促进人皮肤成纤维细胞在的增殖，有利于皮肤创面愈合，在组织修复和再生领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及冻干粉技术加工领域，更具体地，涉及一种脐带间充质干细胞提取冻干粉及制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有显著的自我更新和多向分化的细胞，其来源丰富，主要存在于骨髓、脐血、脐带、全身结缔组织和器官间质，脐带作为一种MSCs的来源有着无法比拟的优势，其与骨髓来源的MSCs比较亦有较明显的优势，如取材容易、来源广、易收集、保存、冷冻及相对纯净等。

成纤维细胞是皮肤真皮组织中的主要细胞类型，可以分泌胶原、弹性蛋白、纤维粘连蛋白等细胞基质成分，对维持皮肤健康至关重要。随着年龄增长，组织中成纤维细胞胶原合成量减少、胶原类型和含量比例改变、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)水平增加、弹性蛋白和纤维粘连蛋白等含量降低或出现结构性异常交联，是皮肤衰老、皱纹产生的重要原因。多项研究指出，MSCs能够向创伤皮肤组织及炎症部位归巢迁移，促进皮肤组织再生、创面修复、减少瘢痕形成，在缓解皮肤炎症、改善纤维化、治疗系统性硬皮病、减轻皮肤放射性损伤等方面均具有很好的效果。

为了使得脐带间充质干细胞便于保存和使用，现有技术是将脐带间充质干细胞制成冻干粉。但是传统的冻干技术容易损伤细胞因子的活性，如果冻干不彻底，脐带间充质干细胞冻干粉极易在保存过程中失去活性，其水化复苏率相对较低，不利于后续的临床施用。

发明内容

针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞提取冻干粉及制备方法。采用本发明的细胞冻存液制备的脐带间充质干细胞冻干粉的水化复苏率可达到96.5％，并且本发明的细胞冻存液之间也存在协同增效的技术效果，尤其是联合海藻糖、脱脂乳和葡聚糖的组合。采用本发明的细胞冻存液制备的脐带间充质干细胞冻干粉能有效促进人皮肤成纤维细胞在的增殖，有利于皮肤创面愈合，在组织修复和再生领域具有广阔的应用前景。

本发明的目的之一是一种脐带间充质干细胞冻干粉的制备方法，具体操作如下：

1)、将脐带间充质原代干细胞接种至DMEM/F12培养基中，在低氧条件下进行传代培养，待原代干细胞融合至90％时，采用1×PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化，完全培养基终止，4℃1000×g离心5min后重悬细胞，按照1:1传代，即可获得第1代脐带间充质原代干细胞；后续逐次传代，并收集第10代的细胞；

2)将第10代细胞采用1×PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化，DMEM/F12完全培养基终止，4℃1000×g离心5min后，采用细胞冻存液重悬后加入细胞冻存管，并进行封口处理；其中所述细胞冻存液为含有10％(w/v)海藻糖、5％(w/v)脱脂乳和10％(w/v)葡聚糖的1×PBS溶液；

3)将步骤2)中的细胞冻存管先至于4℃下静置30min后，按10℃/h的速率降温至-20℃，并于-20℃下放置1h；然后以10℃/h的速率降温至-80℃，并保持该温度1h，最后以2℃/h的速率降温至-196℃，并于该温度下静置过夜，即可制成冻干粉。

本发明的另一目的在于提供一种脐带间充质干细胞冻干粉，所述冻干粉包括脐带间充质干细胞以及细胞冻存液。

进一步地，所述细胞冻存液为含有海藻糖、脱脂乳和葡聚糖的1×PBS溶液；

优选地，所述细胞冻存液为含有10％(w/v)海藻糖、5％(w/v)脱脂乳和10％(w/v)葡聚糖的1×PBS溶液；