[发明专利]一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺

权利要求书

1.一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于包括以下步骤：

1)将异源表达的CHO重组细胞超声破碎，离心后取上层清液，用0.45μm滤器进行过滤得到人绒毛膜促性腺激素原液；

2)将所述人绒毛膜促性腺激素原液上样至交联微球-凝胶层析柱，用pH为5.5～6.5的HCl溶液进行洗脱，280nm分光光度计监控，收集得到人绒毛膜促性腺激素粗液，所述交联-凝胶层析柱的填料由60～70％的磺酸交联微球和30～40％的氯化硅胶构成；

3)将所述人绒毛膜促性腺激素粗液上样至亲和层析柱，用0.5mol/L的NaCl洗涤液洗涤，然后用pH为8.5～9.0的含有1mol/L NaCl的Tris-HCl进行洗脱，收集得到人绒毛膜促性腺激素溶液，然后用稀盐酸调节溶液pH为7，脱盐浓缩，冷冻干燥得到人绒毛膜促性腺激素纯品。

2.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述磺酸交联微球的制备方法包括以下步骤：

1)在二甲基亚砜中加入甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯醇和水，混合均匀后在75～80℃反应8～12h，二甲基亚砜、甲基丙烯酸甲酯、偶氮二异丁腈、聚乙烯醇和水的体积比为(80～90)：(8～10)：(5～6)：(7～8)；

2)反应完成后继续加入2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、丙烯酸和偶氮二异丁腈，混合均匀后在75～80℃反应10～15h，2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、丙烯酸和偶氮二异丁腈的体积比为(1～2)：(1～2)：(1～2)，反复用乙醇和水洗涤后得到磺酸交联微球。

3.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述氯化硅胶的制备方法包括以下步骤：将硅胶放入0.5～1.0％HF水溶液中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，得到氟化硅胶；然后将所述氟化硅胶放入10％的盐酸中，反应完成后过滤，然后用水洗涤至中性，干燥得到氯化硅胶。

4.根据权利要求1所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述亲和层析柱内填充的滤材为HCG受体亲和介质，所述HCG受体亲和介质的制备方法，包括以下步骤：将活化好的琼脂糖珠加到pH8.0～8.5的0.1～0.15M NaHCO₃缓冲液中，然后加入HCG受体，琼脂糖珠、NaHCO₃缓冲液和HCG受体的质量体积比为：(1～1.2)g：(1～1.2)mL：(3～4)g，所述HCG受体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的同一性达到95％以上，在4～5℃下摇转反应8～12h，然后用pH8.0～8.5的0.1～0.15M NaHCO₃缓冲液抽洗，然后用pH8.0～8.5的0.1～0.15M HCl-甘氨酸缓冲液洗涤，干燥得到HCG受体亲和介质。

5.根据权利要求4所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述NaHCO₃缓冲液的pH为8.2。

6.根据权利要求4所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述琼脂糖珠、NaHCO₃缓冲液和HCG受体的质量体积比为：1g：1mL：3.5g。

7.根据权利要求4所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述HCG受体的氨基酸序列选自以下至少一个氨基酸位点进行取代突变：108、136、271、296，所述氨基酸位点参照如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的一种人绒毛膜促性腺激素的多步纯化工艺，其特征在于，所述HCG受体的氨基酸序列选自以下至少一个突变或突变集进行取代突变：M108A/I271L、D136A、M108A/Y296E、Y296E，所述氨基酸位点参照如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。