[发明专利]编辑活性提高的Cas蛋白及其应用

说明书

本发明属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明提供了一种Cas突变蛋白，所述Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白相比，显著的提高了编辑活性，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明涉及一种编辑活性提高的Cas蛋白及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。

CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3’-NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5’-TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5’-TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。

中国发明专利申请CN114672473A中公开了一种氨基酸产生突变的Cas蛋白，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，本申请通过蛋白进化，进一步提高了该蛋白在真核细胞中的编辑范围，扩展了其应用范围。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，通过对Cas蛋白的定点突变和优化组合，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。

Cas效应蛋白

一方面，本发明提供了一种编辑活性提高的Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位。

在一个实施方式中，所述编辑活性提高的Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第233位、第267位、第369位、第433位、第168位、第328位、第505位；所述任意几个选自：任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个或7个。

在优选的实施方式中，所述编辑活性提高的Cas突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位点处存在突变：

第168位氨基酸；

或，第233位氨基酸；

或，第168位氨基酸和第267位氨基酸同时突变；

或，第168位氨基酸和第505位氨基酸同时突变；

或，第233位氨基酸和第267位氨基酸同时突变；

或，第233位氨基酸和第505位氨基酸同时突变；

或，第233位氨基酸、第369位氨基酸和第433位氨基酸同时突变；

或，第233位氨基酸、第267位氨基酸、第328位氨基酸和第369位氨基酸同时突变；

或，第233位氨基酸、第267位氨基酸、第369位氨基酸和第433位氨基酸同时突变；