[发明专利]用于水稻粒增重的重组载体、重组菌、构建方法及其应用

权利要求书

1.一种用于水稻粒增重的重组载体，其特征在于，基础质粒包括定点编辑的GS1；3基因组，所述定点编辑的GS1；3基因组包括gRNA序列碱基靶位点，所述gRNA序列碱基靶位点为GS1；3基因组的第954位到第973位碱基，为：

AATTCAGGGTTGGTGGTACT。

2.一种用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

CRISPR/Cas9靶位点的设计，通过基因网络工具定位GS1；3基因组的靶位点，得到定点编辑的GS1；3基因组；所述定点编辑的GS1；3基因组的gRNA序列碱基靶位点为GS1；3基因组的第954位到第973位碱基，为：AATTCAGGGTTGGTGGTACT；

CRISPR/Cas9载体的构建，以水稻pCRISPR-U3质粒DNA为模板，通过重叠PCR的方法得到连入sgRNA的U3-GS1；3-sgRNA片段；

重组载体提取，将所述U3-GS1；3-sgRNA片段连接至pCXUN-Cas9载体上，连接产物利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到克隆；提取克隆质粒，得到pCXUN-Cas9-GS1；3载体。

3.根据权利要求2所述的用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体的构建的步骤中，所述通过重叠PCR的方法得到连入sgRNA的U3-GS1；3-sgRNA片段的步骤包括：

以pCRISPR-U3质粒DNA为模板，以引物GS1；3-gRNA-F和U3-R进行PCR扩增，得到第一PCR产物；

以pCRISPR-U3质粒DNA为模板，以引物GS1；3-gRNA-R和U3-F进行PCR扩增，得到第二PCR产物；

将得到第一PCR产物和第二PCR产物混合，作为模板，以引物U3-F和U3-R进行PCR扩增，得到第三PCR产物；

将第三PCR产物进行纯化回收，得到所述U3-GS1；3-sgRNA片段。

4.根据权利要求3所述的用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，其特征在于，所述引物的基因序列为：

GS1；3-gRNA-F：AATTCAGGGTTGGTGGTACTgttttagagctagaaatagcaagtta；

GS1；3-gRNA-R：AGTACCACCAACCCTGAATTgccacggatcatctgcacaac；

以上序列所示大写字母为定点编辑后的GS1；3基因组的向导序列，小写字母为水稻pCRISPR-U3质粒DNA的载体序列。

5.根据权利要求3所述的用于水稻粒增重的重组载体的构建方法，其特征在于，所述U3-R和所述U3-F的基因序列为：

U3-F：CCCCTTTCGCCAGGGGTACCGTAATTCATCCAGGTCTCCAAG；

U3-R：TACGAATTCGAGCTCGGTACCGCTGTGCCGTACGACGGTACG。

6.一种用于水稻粒增重的重组菌的构建方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的重组载体，包括下列步骤：将所述重组载体通过热激法转化根癌农杆菌EHA105菌株，得到用于水稻粒增重的重组菌。

7.根据权利要求6所述的用于水稻粒增重的重组菌的构建方法，其特征在于，所述将所述重组载体通过热激法转化根癌农杆菌EHA105菌株的步骤，包括：

从-80℃的保存环境中取出农杆菌感受态细胞，融化后，加入所述重组载体，置冰上30min，得菌液；

将离心管放入液氮中速冻5min后放入37℃水中水浴5min，取出后迅速插入冰中2min，加入液体LB培养基，28℃下震荡培养3h；

吸取所述菌液均匀涂布在含有卡纳霉素和利福平的固体LB平板上，在28℃的培养箱中培养48h；

挑取单克隆于含有卡纳霉素和利福平的液体LB培养基中，在28℃下的摇床中培养24h。

8.根据权利要求1所述的用于水稻粒增重的重组载体在水稻稻粒增重中的应用。