[发明专利]一种生产观蓝的基因工程菌株及应用

说明书

本发明公开了一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，该基因工程菌株IN06，由表达载体pRk‑bpsA‑EntD/95s‑glnA导入底盘菌株IN05构建而得；盘菌株IN05，以大肠杆菌BW25113为起始菌株，将大肠杆菌利用丙酮酸为碳源和能量的代谢路基的基因敲除或者原位突变构建而得，所述表达载体pRk‑bpsA‑EntD/95s‑glnA，以pRk、95s分别为质粒模板，蓝色素合成酶bpsA、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD及谷氨酰氨合成酶glnA为功能基因，经基因合成、优化、扩增构建而得。本发明的基因工程菌株，利用葡萄糖为底物，在体内直接生物合成观蓝，降低成本，绿色环保，无化学残留。

技术领域

本发明涉及一种生产观蓝的基因工程菌株及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

观蓝是一种天然蓝色素，结构式为主要应用于染料行业。

目前，染料行业所使用的染料仍以工业染料靛蓝为主，但工业靛蓝的生产是以化学合成法为主，主要原料为苯胺，对人体的危害较大，所产生的污染较为严重，是工业污染的重要源头之一，而微生物发酵生产蓝色素污染较少且成本较低，已逐步成为工业靛蓝的替代方案，但是目前行业内微生物发酵生产观蓝的产量较低，且成本较高，尚不能工业应用。为了降低成本，实现工业化应用，本发明公开了一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，以葡萄糖为底物，在工程菌株IN06体内直接生物合成观蓝，降低成本，安全稳定，绿色环保，产品纯度高，无化学残留。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生产观蓝的基因工程菌株和发酵方法，该基因工程菌株，即工程菌株IN06，是由表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA导入底盘菌株IN05构建而得；

其中，所述底盘菌株IN05，是以大肠杆菌BW25113为起始菌株，将大肠杆菌利用丙酮酸为碳源和能量的代谢路基的基因敲除或者原位突变构建而得，以增强中心代谢，促进关键蛋白的翻译后修饰；

所述表达载体pRk-bpsA-EntD/95s-glnA，是以质粒pRk、蓝色素合成酶bpsA以及磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶EntD分别经扩增、基因合成、优化后连接而得的目的基因片段pRk-bpsA-EntD与以质粒95s与谷氨酰氨合成酶glnA经基因合成、优化、扩增而得的的基因片段95s-glnA构建而得。

优选地，所述底盘菌株IN05的构建方法，具体的步骤如下：

s1、以大肠杆菌BW25113为起始菌株，插入标签基因筛选prpB基因，敲除prpB基因，并命名为菌株IN01；

s2、在菌株IN01基础上，插入标签基因筛选prpC基因，敲除prpC基因，并命名为菌株IN02；

s3、在菌株IN02基础上，插入标签基因筛选prpD基因，敲除prpD基因，消除大肠杆菌利用丙酮酸作为碳源和能量的能力，并命名为菌株IN03；

s4、将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp基因经PCR扩增，获得基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp，再以95s为质粒模板，将基因片段磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶sfp与质粒95s连接，获得表达质粒95s-sfp，获得表达质粒95s-sfp，再选用119启动子对表达质粒95s-sfp进行定点突变，获得质粒95s-119-sfp；

s5、在菌株IN03基础上，插入标签基因筛选prpR基因，继续敲除prpR基因，并在该基因位点引入质粒95s-119-sfp，并命名为菌株IN04；

s6、在菌株IN04基础上，插入标签基因筛选prpE基因，选用119启动子在prpE基因上进行原位突变，获得底盘菌株，并命名为底盘菌株IN05。