[发明专利]一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用

说明书

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，公开了一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用，三七病程蛋白基因PnPR4的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。三七病程蛋白基因PnPR4在提高三七对真菌抗性中的应用。应用验证方法包括：分离三七的一个病程相关蛋白基因的蛋白质编码区段，利用大肠杆菌对目的基因进行原核表达，并验证所述基因进行重组表达后的蛋白是否能抑制病原菌生长，为三七抗病育种中基因的选择应用提供了相应的参考。

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，尤其涉及一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用。

背景技术

目前，三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]抗病品种少，在种植过程中易受根腐病危害，防治根腐过程中农药的使用会导致农药残留及重金属超标等诸多问题，使三七品质下降，不利于三七产业的可持续发展。三七抗病品种的选育是解决三七根腐问题的有效策略，抗病基因的挖掘是三七抗病育种的重要环节。

与多数植物一样，三七受到致病菌侵染后，一系列基因响应而上调表达，产生防御反应，其中一些基因与防御反应相关，包括病程相关蛋白(PR)和抑菌基因，病程相关蛋白(PR)的合成和积累已被证实在防御致病性感染中发挥重要作用。根据PR蛋白的结构和功能，PR蛋白被分为17个家族，存在于单子叶植物和双子叶植物中。其中PR-4蛋白是病程相关蛋白中的一类，PR-4蛋白(13-16kDa)最初被归为内几丁质酶。这类蛋白包含三个分子内二硫键和一个保守的c结构域BARWIN结构域。根据PR4蛋白质n端富含半胱氨酸区域的存在，被细分为两类。I类PR-4蛋白在保守的n端部分有一个富含半胱氨酸的几丁质结合域(称为hevein域)，这种结构可使蛋白质与病原体几丁质结合，这解释了它们抗真菌的能力。II类PR-4蛋白不含几丁质结合域，功能多样化，涉及生物和非生物胁迫，在多种植物中都已分离得到。

三七根腐病主要通过施用化学农药进行防治，对药材品质和安全性有一定程度的影响；现有技术尚没有利用三七病程蛋白基因PnPR4进行三七根腐病抗性增强的方法。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术尚没有利用三七病程蛋白基因PnPR4增强三七根腐病抗性的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用。

本发明是这样实现的，一种三七病程蛋白基因PnPR4，所述三七病程蛋白基因PnPR4的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

进一步，所述三七病程蛋白基因PnPR4包含完整的开放阅读框，编码为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明的另一目的在于提供一种所述三七病程蛋白基因PnPR4在提高三七对真菌抗性中的应用。

进一步，所述真菌包括：草茎点霉(Phoma herbarum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、毁灭柱孢菌(Ilyonectria destructans)。

本发明的另一目的在于提供一种验证方法包括：

分离三七的一个病程相关蛋白基因的蛋白质编码区段，利用大肠杆菌对目的基因进行原核表达，并验证所述基因进行重组表达后的蛋白是否能抑制病原菌生长。

进一步，所述验证方法包括以下步骤：

步骤一，采用RNA提取试剂盒提取三七的总RNA，以提取的所述三七的总RNA为模板，进行逆转录，通过逆转录聚合酶链式反应将所述三七的总RNA逆转录为cDNA，基于所述cDNA进行PnPR4基因的克隆；

步骤二，设计带有和载体具有相同位点的同源臂引物，从有目的基因的pGEM-T载体中扩增，并将扩增产物通过同源重组连接到原核表达载体pET-32a中；