[发明专利]一种花生致敏原天然抗原的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种花生致敏原天然抗原的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：（1）原料预处理：取新鲜、除尘后的花生粉碎、过筛，收集备用；（2）脱脂处理：加入脱脂溶剂，搅拌离心、弃上清液、直至离心分层后的上清液无色时脱脂处理结束，收集的下层固相沉淀物备用；（3）蛋白提取：加入提取液，搅拌、离心、过滤，收集的上清液备用；（4）除杂以及保存：加入硫酸铵，搅拌混合、离心，去除上层漂浮的杂质，收集的澄清液体进行透析处理，透析后的截留液进行过滤，收集的滤液即为抗原，再加入抗原储存液进行保存备用。采用上述方法制备的抗原，具有较好的稳定性、特异性。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种花生致敏原天然抗原的制备方法及其应用。

背景技术

食物过敏是人体对某种食物而产生的不良免疫反应，主要分为IgE介导和非IgE介导的两种方式。其中花生过敏是一种发病率高且凭现有技术难以治愈的过敏性疾病，具有严重的危害性，少量花生即可引起过敏患者强烈的过敏反应，甚至可引起患者休克或死亡。据统计，全球约有1%-3%的儿童被花生过敏问题所困扰。其症状常表现为哮喘、过敏性鼻炎、水肿性风团或红斑、皮肤瘙痒等。但至今尚无针对这一疾病的有效治疗方法，患者需避免食用或遵医嘱进行脱敏治疗，故研发花生变应原诊断试剂尤为重要。

花生过敏主要为IgE介导的1型超敏反应，患者对花生过敏程度与体内产生的特异性IgE的数量呈正相关，故可通过检测患者体内特异性IgE来判断患者过敏程度，但特异性IgE一般在患者接触过敏原1-2天达到峰值，随后很快开始下降，特异性IgG一般在体内可存在较长时间，表现为不耐受。目前，WHO/IUIS已命名并记录了花生中具有致敏性的蛋白有18种。对于花生诊断试剂国内外均有研究，但进口国外试剂价格昂贵，国内试剂差异较大。花生过敏试剂主要包括两种，即天然花生抗原与重组纯化抗原，其中花生重组纯化抗原制备过程较复杂，操作不当易功亏一篑。因此针对上述问题，有必要开发一种花生致敏原天然抗原的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在的不足，提供一种花生致敏原天然抗原的制备方法，该制备方法制备出的天然抗原成本较低，产量较大，操作简单，免疫原性强、特异性好。

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：

一种花生致敏原天然抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）原料预处理：取新鲜、除尘后的花生，在液氮条件下进行粉碎、过筛，收集的花生粉末备用；

（2）脱脂处理：取步骤（1）的花生粉末，按照料液比1:5-10的比例加入脱脂溶剂，搅拌离心、弃上清液，上述操作重复多次直至离心分层后的上清液无色时脱脂处理结束，收集的下层固相沉淀物备用；其中所述脱脂溶剂包括丙酮和TCEP，且所述TCEP在脱脂溶剂中的含量为2-5mM；

（3）蛋白提取：取步骤（2）中的固相沉淀物，按照料液比1:10-20的比例加入提取液，搅拌、离心、过滤，收集的上清液备用；其中所述提取液的pH为7.8-8.2，所述提取液为含有0.5-1mMDTT和40-60mM的Tris-HCl缓冲液；

（4）除杂以及保存：取步骤（3）中上清液，加入硫酸铵，并使得上清液中硫酸铵的终饱和度为50%，搅拌混合、离心，去除上层漂浮的杂质，收集的澄清液体进行透析处理，透析后的截留液进行过滤，收集的滤液即为抗原，再加入抗原储存液进行保存备用。

作为一种改进的技术方案，步骤（2）脱脂处理时的温度保持在0-4℃。

作为一种优选的技术方案，步骤（3）中提取液的pH为8.0，所述提取液为含有1mM的DTT和50mM Tris-HCl缓冲液。