[发明专利]一种花生致敏原天然抗原的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种花生致敏原天然抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）原料预处理：取新鲜、除尘后的花生，在液氮条件下进行粉碎、过筛，收集的花生粉末备用；

（2）脱脂处理：取步骤（1）的花生粉末，按照料液比1:5-10的比例加入脱脂溶剂，搅拌离心、弃上清液、上述操作重复多次直至离心分层后的上清液无色时脱脂处理结束，收集的下层固相沉淀物备用；其中所述脱脂溶剂包括丙酮和TCEP,且所述TCEP在脱脂溶剂中的含量为2-5mM；

（3）蛋白提取：取步骤（2）中的固相沉淀物，按照料液比1:10-20的比例加入提取液，搅拌、离心、过滤，收集的上清液备用；其中所述提取液的pH为7.8-8.2，所述提取液中为含有0.5-1mM的DTT和40-60mM的Tris-HCl缓冲液；

（4）除杂以及保存：取步骤（3）中上清液，加入硫酸铵，并使得上清液中硫酸铵的质量浓度为50%，搅拌混匀、离心，去除上层漂浮的杂质，收集的澄清液体进行透析处理，透析后的截留液进行过滤，收集的滤液即为抗原，再加入抗原储存液进行保存备用。

2.根据权利要求1所述的一种花生致敏原天然抗原的制备方法，其特征在于，步骤（2）脱脂处理时的温度保持在0-4℃。

3.根据权利要求1所述一种花生致敏原天然抗原的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的提取液pH为8.0，所述提取液为含有0.1mM的DTT和50mM Tris-HCl缓冲液。

4.根据权利要求1所述的一种花生致敏原天然抗原的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的提取液分3次加入，第一次加入量为提取液总体积的一半，在4℃的条件下搅拌2h，将上层液体吸出保存，向沉淀物中加入剩余提取液总体积的一半，搅拌1h后将上层液体吸出保存，再将剩余的提取液加入沉淀物中，搅拌30min，将上层液体吸出后与前两次吸出保存的上层液体混匀，离心、留上清。

5.根据权利要求1所述的一种花生致敏原天然抗原的制备方法，其特征在于，步骤（4）中加入硫酸铵时，搅拌混匀的温度控制在0-4℃，透析处理的时间为70-74h。

6.根据权利要求1所述的一种花生致敏原天然抗原的制备方法，其特征在于，步骤（4）中的抗原储存液包括pH7.8-8.2的Tris缓冲液、0.1%w/v的NaN₃和10-15%v/v的甘油。

7.一种如权利要求1花生致敏原天然抗原的制备方法所得的抗原在检测花生过敏原特异性IgG抗体酶联免疫试剂盒或斑点金渗滤试剂盒中的应用。