[发明专利]一种原代上皮细胞的培养体系和应用

说明书

本发明提供一种原代上皮细胞的培养体系和应用，按重量百分比计，所述培养体系包括基础培养基81.5‑97.5％、胎牛血清小于2％且不小于0.5％、抗生素1‑5％和添加剂0.5‑2％，所述添加剂包括多种生长因子。本发明还提供该培养体系在培养上皮细胞以及肠上皮屏障功能实验中的应用。本发明能够实现在低血清条件下长期稳定培养上皮细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种原代上皮细胞的培养体系和应用。

背景技术

上皮细胞是一类位于皮肤或腔道表层的特定类型的细胞，可以根据其形态及功能对此类细胞进行分类。分布范围最广的是被覆上皮，此类上皮主要分布在哦体表皮肤和有腔器官的表面，其功能相对单一，主要起到分隔生物体组织内外环境的作用。上皮细胞的另一大类是腺上皮细胞，多数以零散分布于被覆上皮中的形式存在，承担分泌酶、粘液或激素等物质的功能，根据其存在形式是单细胞还是多细胞，有无导管及分支链接又可以进行细分。除了上述两大类，还有很多功能特化的上皮细胞例如：感觉上皮，主要位于舌、眼、耳、鼻中，接受特定理化刺激；生殖上皮，指覆盖在生殖腺表面的一群上皮细胞，在特性上其与一般上皮的区别主要有两点，一是在发育时，这是最初覆盖于生殖腺原基表面的细胞，其内包含原始的生殖细胞，在形态上较常规的腔道上皮厚；肌上皮，一种位于腺上皮及其导管和基底膜之间的富含肌动蛋白的有收缩功能的细胞，其主要功能是通过收缩辅助腺泡通过导管排出分泌物。

传统的培养上皮细胞的方法还是一般通过基础培养基和血清的组合，但是对于部分上皮细胞来说，较高的血清浓度虽然能促进其生长，但是也会诱导其发生上皮细胞-间充质转化(EMT)，使得其生长和生理特性向间质细胞转化，此外原代分离后的细胞悬液中不可避免的会含有间质细胞等杂细胞，而此时培养基中10％以上比例的高胎牛血清环境中间质细胞的增殖速度明显较上皮细胞要快，在加上上皮细胞的EMT通常经过1-2次传代后，间质细胞会成为占绝对优势的细胞群体，导致无法获得足够纯度和量的上皮细胞。面对这种问题通常改善的方式是用5％的胎牛血清，配合一定浓度的EGF和胰岛素维持上皮细胞的生长；但是5％血清的浓度依旧较高，不能满足很多上皮细胞长时间增殖培养的需求，对EMT和间质细胞的生长抑制也很有限。

申请公开号为CN105647850A的中国发明专利，公开一种上皮培养体系，包括上皮培养基和上皮添加剂；所述上皮添加剂其组成成分及浓度为：重组人表皮细胞生长因子25ng/ml，氢化可的松100ng/ml，重组人胰岛素10ug/ml，人全铁转铁蛋白5ug/ml，腺嘌呤0.18mM，霍乱毒素0.1nM，三碘甲状腺氨酸20-12M，本发明的上皮培养体系，配置简单，通过上皮培养基和上皮添加剂配合使用，能够在2％血清的环境下促进上皮细胞的生长活性，也可以部分抑制成纤维和平滑肌细胞的活性，减少杂细胞的污染。但是，该专利在添加剂中使用了霍乱毒素，虽然作为一种腺苷酸环化酶激活剂，它能够刺激多种上皮细胞的增值，与钙离子的转运相关并促进细胞贴壁；但是作为一种毒性蛋白，其使用有一定生物安全风险。此外该专利的添加成分种类较少，只能适用于少量特定类型的上皮细胞的培养，适用范围有限。

发明内容

为解决现有技术中培养基中针对上皮细胞的营养供应特异性较弱和高浓度血清诱导上皮EMT的问题，本发明的目的是提供一种原代上皮细胞的培养体系和应用，能够实现在低血清条件下长期稳定培养上皮细胞。

根据本发明的第一方面，提供一种原代上皮细胞的培养体系，按重量百分比计，包括：基础培养基81.5-97.5％、胎牛血清小于2％且不小于0.5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。

进一步地，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。

进一步地，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。