[发明专利]湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用。一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基，包括：Advanced DMEM/F‑12基础培养基、N‑2添加剂、B‑27添加剂、GlutaMax、青霉素、链霉素、HEPES、烟酰胺、N‑乙酰‑L‑半胱氨酸、表皮生长因子、Wnt3a蛋白、R‑spondin1蛋白、Noggin蛋白、胰岛素样生长因子1、成纤维细胞生长因子10、CHIR99021、A8301、SB202190、Y27632。该培养基可实现从原代湖羊瘤胃上皮细胞诱导构建出湖羊瘤胃上皮类器官，类器官形成率可达15％以上，培养形成的类器官具有与组织相似的复层结构。

技术领域

本发明属于动物组织培养技术领域，涉及一种类器官培养方法，具体涉及一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基、上皮类器官的体外构建方法及应用。

背景技术

反刍动物的复胃包括瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃，其中成年反刍动物的瘤胃可占复胃总容积80％，是反刍动物主要产能场所，在反刍动物适应复杂生态环境的过程中发挥了重要作用。瘤胃上皮属于复层鳞状上皮，具有屏障、免疫、能量代谢等功能，从下往上分别为基底层、棘层、颗粒层与角质层。角质形成细胞从基底层开始向上迁移，不断分裂分化，直到形成死亡的角质层。

在反刍动物养殖过程中许多与营养代谢相关的问题与瘤胃相关，直接利用反刍动物进行试验，花费较为高昂、影响动物福利且试验周期较长，因此需要探索一种可降低试验成本减少活体动物消耗的方法。类器官是一种在体外由成体干细胞或多能干细胞诱导形成，具有与体内组织相似结构与功能的复杂3D结构，在发育生物学、疾病建模、药物开发、再生医学等领域有非常重要的应用前景。从2009年科学家成功建立小鼠小肠类器官以来，包括皮质、腺垂体、甲状腺、视杯、食管、胃、结肠、前列腺、肝脏、皮肤等多种组织在内的类器官相继被成功构建。2017年类器官被Nature Methods评为生命科学领域年度技术，国家重点研发计划也将类器官收录在内，说明类器官在探索生物学方面具有巨大潜力。目前，关于瘤胃上皮的体外模型，国内外已有文献报道从奶牛、山羊和绵羊的瘤胃上皮组织分离瘤胃上皮细胞并建立长期培养体系，而相比于2D培养更能反映复杂组织结构的3D类器官培养尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种湖羊瘤胃上皮类器官的体外构建方法，该方法得到的湖羊瘤胃上皮类器官，保留了类似瘤胃上皮组织的结构，可用于体外试验，从而降低试验成本。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种湖羊瘤胃上皮类器官培养基，该培养基包括：Advanced DMEM/F-12基础培养基、N-2添加剂、B-27添加剂、GlutaMax、青霉素、链霉素、HEPES、烟酰胺、N-乙酰-L-半胱氨酸、表皮生长因子(EGF)、Wnt3a蛋白、R-spondin1蛋白、Noggin蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子10(FGF10)、CHIR99021、A8301、SB202190、Y27632。该培养基中由于添加了CHIR99021、A8301、SB202190、Y27632这四种组分，得以成功的培养出湖羊瘤胃上皮类器官。

类器官可以从成体干细胞或多能干细胞诱导，对于从成体干细胞诱导的类器官而言，类器官培养的关键在于成体干细胞的分离与类器官培养基的构建。瘤胃基底层细胞通过分裂分化使瘤胃上皮细胞不断更新，具有干细胞特征，因此分离瘤胃上皮基底层细胞并通过类器官培养基诱导形成类器官具有可行性。类器官培养基中各种添加剂是诱导成体干细胞分裂分化形成类器官的关键因素，发明人前期设计了数十种培养基均不能实现湖羊瘤胃上皮类器官的培养，最终发现同时添加CHIR99021、A8301、SB202190和Y27632四种小分子抑制剂的类器官培养基可以成功诱导湖羊瘤胃上皮类器官的建立。