[发明专利]一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂

说明书

本发明提供一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂，首先将血液样本中加入血液选择裂解液A和病原微生物助沉剂选择性裂解血细胞并通过高速离心沉降病原微生物，然后加入血液选择裂解液B进行再次血液样本选择裂解，再加入洗涤液混匀后洗涤，最后加入核酸提取试剂，离心富集病原微生物后配合物理方法裂解，得到病原微生物核酸样本。本发明可从不大于10mL的血液样品中，快速准确的提取到能满足分子生物学检测要求的目标感染病原体核酸，无需血液培养，直接使用血液样本进行病原体富集和核酸提取，同时也适用于血培后样本，核酸提取步骤简单，无需复杂处理设备，所得核酸可用于多种分子生物学下游检测。

本申请是申请日为2021年3月31日，申请号为202110346173.9，发明名称为“一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及包含酶、核酸或微生物的测定或检验方法技术领域，具体涉及一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂。

背景技术

血流感染是指由细菌、真菌等病原微生物入侵血流所致的全身性炎性反应综合征。病原微生物在循环血液中呈一过性、间歇性或持续性存在，对机体所有器官，如心脏瓣膜、关节等造成损害，严重者可导致休克、多器官衰竭，弥散性血管内凝血，甚至死亡。目前将败血症和菌血症统称为血流感染。败血症是由各种病原微生物(细菌或真菌)和毒素侵人血流所引起的血液感染。若细菌仅短暂人血而无临床明显的毒血症状则称为菌血症，可分为原发性和继发性两种。原发性菌血症与静脉内操作有关，继发性菌血症大多数由术后伤口、腹腔、尿道及肺部感染引起。近年来由于静脉导管留置、机械通气、肠外给药等侵入性设备及治疗的广泛应用，以及免疫抑制剂和大量抗菌药物的滥用，血流感染的发病率逐年上升，且由于血流感染不仅病死率高而且延长住院时间、增加住院费用等，因而受到了越来越多医患及研究者的重视。

引起血流感染最常见原因是细菌，例如大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和肺炎球菌。除细菌感染外，真菌感染在最近已成为该疾病的重要原因。血流感染诊断和治疗方法的发展已有三十年历史，却仅有很少的进展。从血液样本中培养微生物，使微生物含量从1～10CFU/mL增加到10⁶～10⁸CFU/mL仍然是检测血流感染的金标准。但是这种方法有很多缺点，首先是诊断时间较长，从病人取样到提供样品的感染结果之间通常需要1～5天的诊断时间。在这段时间内，通常疗法是给病人使用广谱的非靶向性的抗生素进行治疗。这可能会在治疗该疾病方面取得效果，但会有很严重的后果，就是很多微生物会产生多重抗药性。其次，培养方法需要大量的诊断所需的血液样品且检测灵敏度很低。此外，在采血和血样使用过程中有相对较高的污染风险。所以虽然目前血培养仍然为血流感染诊断的主要参考方法，但因其灵敏度低且耗时长等显著缺点的存在，因此并不是一个理想的金标准。

随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应(PCR)及二代测序技术为代表的分子生物学诊断技术开始被应用于血流感染的微生物检测。基于分子生物学诊断的方法具有速度快，高灵敏度，小样本量，短时间(一般不超过12小时)内提供微生物诊断相关信息及随后可引入适当的抗生素治疗(检测耐药基因)等显著优势。但是长期以来，由于血液中极低的循环微生物数量(1～10CFU/mL)，血液本身大量人类核酸可能会干扰PCR及测序的检测，同时，血液本身的成分,如铁、血红蛋白等以及血液抗凝剂会对PCR及文库构建产生严重的抑制，因此，直接从全血对微生物进行微生物诊断一直受到限制。

因此快速的从全血中分离、富集到病原微生物并提取到可以用于分子生物学检测的核酸将有效的提高血流感染病原微生物的检测效率，及时为医生合理、针对性用药及治疗提供指导，同时给病人争取到黄金治疗时间，从而增加病人的生存率。

发明内容