[发明专利]一种血液中病原微生物分离、富集和核酸提取方法及试剂

权利要求书

1.一种血液中病原微生物核酸样本的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1)血液样本初次裂解：将血液样本中加入血液选择裂解液A和病原微生物助沉剂，充分混匀后得到裂解物；并使所述裂解物中的大分子有机物溶解，高速离心后弃除部分上清液，得到血液初次裂解样本；

其中，所述裂解物包括裂解的血细胞和未裂解但表面特性改变的病原微生物，所述血细胞包括红细胞和白细胞，高速离心沉降用于使所述病原微生物富集沉淀；

所述血液选择裂解液A包括：浓度为10～100mM的缓冲液、质量体积百分比为0％～6.5％的辅助裂解盐、质量体积百分比为5％～65％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～5％的表面活性剂、浓度为0～10mM的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，所述血液选择裂解液A的pH为4～8；

S2)血液样本再裂解：向步骤S1中的血液初次裂解样本中，加入血液选择裂解液B，使残留的大分子有机物进一步溶解，高速离心后弃除所述微生物助沉剂与水性溶液界面上的部分上清液，得到血液再次裂解样本；

所述血液选择裂解液B包括：浓度为10～100mM的缓冲液、质量体积百分比为0％～3％的辅助裂解盐、质量体积百分比为0％～40％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～2％的表面活性剂、浓度为0～10mM的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂，所述血液选择裂解液B的pH为5～8；

S3)洗涤：向步骤S2中的血液再次裂解样本中，加入洗涤液混匀后离心，弃除部分上清液，得到包含所述未裂解但表面特性改变的病原微生物的血液裂解样本，所述洗涤液用于清洗杂质；

S4)核酸提取：在步骤S3中洗涤后的血液再次裂解样本中，加入核酸提取试剂，高速离心后弃除部分上清，将剩余溶液进行电裂解或加入不同粒径组合的研磨珠振荡后高温加热、离心，使所述未裂解但表面特性改变的病原微生物裂解，并促使所述未裂解但表面特性改变的病原微生物中的核酸释放、溶解，得到病原微生物核酸样本；

所述主要裂解盐选自以下一种或多种：氯化锂、碘化钠、碘化钾、盐酸胍和异硫氰酸胍；

所述辅助裂解盐选自以下一种或多种：氯化钠、氯化钾和硫酸铵；

优选地，所述提取方法的血液样本为不经血液培养的样本或经血液培养后的样本；

更优选地，所述血液选择裂解液A与血液的渗透压差和表面活性剂的添加使血细胞破裂；优选地，所述血液选择裂解液A中的盐类、表面活性剂与微生物助沉剂一起促进因具有特殊细胞外结构(如细菌荚膜)而难以离心沉淀的病原微生物富集沉淀，减少微生物的差异化富集；

更优选地，所述血液选择裂解液B的添加弥补因样本差异造成的裂解处理不完全并充分溶解残留杂质。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤S1中，所述血液选择裂解液A由浓度为10～100mM的缓冲液、质量体积百分比为0％～6.5％的辅助裂解盐、质量体积百分比为5％～65％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～5％的表面活性剂、浓度为0～10mM的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂组成；

所述病原微生物助沉剂为不溶于水的生物惰性有机溶剂；

所述血液样本为1～10ml，加入所述血液选择裂解液A和所述病原微生物助沉剂后常温振荡混匀或常温颠倒混匀1～5分钟，所述血液选择裂解液A的用量为所述血液样本体积的0.5～5倍，所述病原微生物助沉剂的用量为所述血液样本体积的0.5％～5％；

优选地，所述大分子有机物包括蛋白质、糖类、脂类和核酸等。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：

步骤S2中，所述血液选择裂解液B由浓度为10～100mM的缓冲液、质量体积百分比为0％～3％的辅助裂解盐、质量体积百分比为0％～40％的主要裂解盐、质量体积百分比为0％～2％的表面活性剂、浓度为0～10mM的螯合剂和体积百分比0％～0.5％的消泡剂组成；

所述血液选择裂解液B的用量为所述血液初次裂解样本体积的2～10倍；

步骤S3中，所述洗涤液包括：浓度为10～100mM的所述缓冲液、质量体积百分比为0％～5％的促进杂质溶解盐和浓度为0～10mM的所述螯合剂，所述洗涤液的pH为5～9；

所述洗涤液的用量为所述血液再次裂解样本体积的5～10倍，所述洗涤液的使用方法为常温震荡混匀或常温颠倒混匀；

步骤S2、S3可重复多次。