[发明专利]一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法

说明书

本发明公开了一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。本发明提供了一种鉴别或辅助鉴别植物单倍体诱导系的诱导后代中单倍体的方法，包括如下步骤：1)创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系；所述创制的方法为将可视化标记基因转移到植物单倍体诱导系中，得到表达可视化标记基因的单倍体诱导系；2)将所述表达可视化标记基因的单倍体诱导系与植物其他品种杂交，得到F1代，在F2代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别。所提供的方法对小麦单倍体育种、DH群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。

背景技术

传统育种方法育成一个优良小麦品种至少需要8-10年，而单倍体育种采用孤雌生殖或雄核发育产生单倍体，经过加倍后直接产生纯合双单倍体，经过一次培养或诱导就能产生全部基因同质的纯合二倍体，繁殖种子后就可参加产量鉴定和适应性试验，大大缩短了育种周期，提高了育种效率。

小麦单倍体最早主要通过花药培养和小孢子培养诱导产生，但花药培养和小孢子培养存在强烈的基因型依赖性和严重的白化苗现象，大多数基因型或杂种组合不能通过花药培养和小孢子培养获得再生植株，育种群体难以形成规模。另外，花药培养和小孢子培养诱导单倍体的程序比较复杂，要求一定的实验设备和条件。上世纪80年代末期发现，小麦与玉米杂交后玉米染色体逐步从合子胚中消失，产生无胚乳发育的小麦单倍体胚籽粒，经过幼胚拯救培养可以获得小麦单倍体植株。小麦与玉米杂交诱导小麦单倍体技术受环境条件和实验设施的影响较大，单倍体胚和单倍体植株诱导效率较低，应用范围受到限制。

近年来利用基因编辑技术敲除MTL(PLA)基因、DMP基因，PLD3基因等可以有效的诱导母本单倍体，中国农业大学陈绍江教授团队利用CRISPR/Cas9技术编辑小麦中ZmMTL基因的同源基因TaPLA，获得了同时敲除TaPLA-A和TaPLA-D的突变体，单倍体诱导率为2-3％(Liu et al.,2020a)。目前有研究在优化利用CRISPR/Cas9编辑小麦基因技术体系的基础上，编辑小麦中ZmMTL基因的同源基因TaMTL，获得了mtl-A、mtl-AD、mtl-BD和mtl-ABD共4种类型纯合突变体，其中3个等位基因同时突变的mtl-ABD自交后代中单倍体诱导率为18.9％。

单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、DNA总量、基因拷贝数、花粉活性、植株高度和育性等。通过花药培养、小孢子培养和远缘杂交等技术诱导产生的植株几乎全部为单倍体。但通过CRISPR/Cas9技术编辑MTL基因或诱导系授粉产生的单倍体胚，其频率只有1-20％，需要在籽粒发育阶段辨别单倍体和二倍体，以便进行染色体加倍。

小麦单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、DNA总量、流式细胞倍性、基因拷贝数和植株高度等。通过花药培养、子房培养和远缘杂交等技术诱导产生的小麦植株几乎全部为单倍体，可以全部直接进行染色体加倍处理获得纯合二倍体植株。但是，通过CRISPR/Cas9技术敲除TaMTL基因创制的小麦单倍体诱导系与其它品种杂交后的籽粒中既有单倍体又有二倍体，他们在外观形态上没有差异。由于源于TaMTL基因敲除诱导系诱导小麦单倍体的频率还比较低，从育种角度出发，需要尽可能在早期大量、快速、准确鉴定出单倍体，以便对单倍体及时进行染色体加倍。然而，在目前鉴定小麦单倍体的几种方法中，有的方法操作复杂、费时、需要特殊仪器设备，有的方法需要较多样品或在植株生长到足够大时才能进行，不适用于幼苗萌发阶段对单倍体进行大规模鉴定，急需开发一种对利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体进行快速、准确的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。