[发明专利]一种新型体内生成CAR-T的方法

权利要求书

1.一种新型体内生成CAR-T的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、CAR基因序列片段制备：采用CAR基因序列，通过引物1和引物2进行PCR扩增，再通过核酸凝胶电泳，将1500bp位置的最亮的条带，切胶回收，得到CAR基因序列片段；

引物1：CTCTAGCCCTCGAGAAGCTTGCCACCATGGGTGTC；

引物2：GGGCCCGCGGTACCGTCGACTCATCTGGGGGCCAG；

S2、CAR基因序列菌液制备：采用无缝克隆技术将CAR基因序列片段插入到逆转录病毒载体pCDH中，通过测序鉴定挑选构建正确的CAR序列菌液；

S3、制备含CAR基因的逆转录病毒：将CAR序列菌液培养基中摇床摇菌，提取CAR质粒，将逆转录病毒包装的辅助质粒（pMD2.G和pSPAX2）和CAR质粒共转染HEK293T细胞，包装成含有CAR基因的逆转录病毒，超滤纯化后测定病毒滴度，选取病毒滴度在10^9/ml以上的逆转录病毒；

S4、均一透明溶液制备：将包含可电离的阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙烯乙二醇脂质的乙醇脂质混合物在水中溶解为均一透明溶液；

S5、包装逆转录病毒的靶向脂质纳米颗粒的制备：在均一透明溶液中添加适量的含CAR基因的逆转录病毒，均一透明溶液中脂质的氮与病毒表面蛋白的磷比例为40:1，快速混合后，在4℃下孵育2小时，得到包装逆转录病毒的靶向脂质纳米颗粒；

S6、脂质纳米颗粒修饰：将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）-聚乙二醇（PEG）-顺丁烯二酰亚胺（mal）（DSPE-PEG-mal）与包装逆转录病毒的靶向脂质纳米颗粒按摩尔比例4:1混合后，60℃孵育1小时，获得修饰的脂质纳米颗粒；

S7、抗体巯基引入：将N-丁二酸S-乙酰基巯基乙二醇酯（SATA）按10倍摩尔量加入到目标抗体中，室温反应30min，通过目标抗体表面的伯胺引入巯基，诱导每个抗体形成1个巯基；

S8、抗体修饰：将0.5M的N-羟胺按体积比1:10的比例加入到含巯基的目标抗体中，孵育2小时，对乙酰化巯基去保护，将去离子水溶胀好的葡聚糖凝胶G-25，倒入层析柱内，并平衡层析柱，将去保护的目标抗体溶液用0.45μm滤膜过滤后，加入到层析柱中，用去离子水洗脱，来去除未反应的组分，最终得到SATA修饰的抗体；

S9、抗体接入：将SATA修饰的抗体上的巯基，按照摩尔比例1:2000，通过硫醚偶联反应偶联到修饰的脂质纳米颗粒的顺丁烯二酰亚胺一端；

S10、纯化：将接入抗体的脂质纳米颗粒用Sepharose CL-4B凝胶柱进行纯化，去除未偶联抗体的脂质纳米颗粒；

S11、体内植入：将制备好的脂质纳米颗粒，经尾静脉注射到目标活体体内。

2.根据权利要求1所述的一种新型体内生成CAR-T的方法，其特征在于，所述S2、CAR基因序列菌液制备步骤包括如下步骤：

A1、无缝克隆：采用同源重组酶、CAR基因序列片段、双蒸水，通过XbaI和NotI两个限制性内切酶，酶切开线性化pCDH载体，其反应体系为10ul体系：同源重组酶2ul、CAR基因序列片段50ng、线性化pCDH载体100ng、其他由双蒸水补齐10ul，温度控制在50℃，反应时间为15min，得到无缝克隆产物；

A2、转化与涂板：取无缝克隆产物5ul，加入到提前化冻的感受态中，轻轻吹打几次，然后置于冰上10-20min，打开42℃水浴锅，进行热激，热激结束后迅速置于冰上静置2min，加入到100ul氨苄抗性LB培养基，37℃摇床1h，然后吸取至LB平板上，并用涂菌棒涂匀LB平板，将LB平板放于37℃培养箱过夜培养；

A3、挑菌与测序：在LB平板中，随机挑取若干菌斑，放入含有氨苄抗性LB液体培养基1ml的EP管中，控制在37℃、220rpm，摇床摇菌6-8小时，菌液浑浊，各取100ul测序1500bp的长度，将得到测序结果和CAR基因序列进行比对，比对正确的菌液，得到CAR基因序列菌液。