[发明专利]一种副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidase M15、其基因及制备方法和应用

说明书

本发明提供一种副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidaseM15，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了所述的裂解酶peptidase M15制备方法，通过大肠杆菌原核表达系统表达并纯化的裂解酶peptidaseM15同时具有裂解宿主谱广以及高效抗菌作用的优点，在针对水产以及公共卫生领域抗生素耐药的副溶血弧菌感染方面有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于重组DNA生物技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidase M15、其基因及制备方法和应用。

背景技术

副溶血弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，广泛分布在海水、淤泥以及鱼虾贝类等水产动物体内，能引起虾红体病、鱼类皮肤溃烂等水产动物疾病，是水产养殖业的主要致病菌之一。同时副溶血弧菌还可以导致包括伤口感染、败血症或更常见的急性胃肠炎等多种人类疾病。由于抗生素耐药性问题愈发严重，大多数抗生素将逐渐失去作用，与此同时，新型抗生素的开发速度较为缓慢，亟需研制一种从生物安全性角度出发的有效抗菌药物。

噬菌体是一类专门侵染细菌的病毒，英文名为bacteriophage，由Twort和Felixd’Herelle于1917年所发现。噬菌体以细菌为宿主，并在细菌体内进行复制和增值。在感染细菌的末期，裂解性噬菌体释放细胞壁水解酶，从而释放出子代噬菌体颗粒，并导致细菌的裂解和死亡。

目前噬菌体应用于食品、水产养殖、畜禽、疾病防控等多个领域来控制耐药性病原菌的感染。然而噬菌体的应用具有颇多的局限性，如噬菌体裂解谱较窄，多数噬菌体仅能特异性裂解一种宿主菌；易产生抗性等，因此克服这些局限性成为噬菌体应用首要解决的问题。噬菌体所表达的细胞壁水解酶又称为裂解酶，它具有高特异性、快速起作用、高效率和低耐药风险等特点，能从水解细菌病原体肽多糖进而杀灭细菌，被认为是后抗生素时代抗生素的替代治疗剂。然而，目前一些研究报道的噬菌体裂解酶，如Lysin1902需要在外源添加剂的作用下才能发挥抗菌作用(王瑜欣等.噬菌体裂解酶Lysin1902原核表达及其与ε-聚赖氨酸联用效果评价[J/OL].微生物学报)，因此，摆脱外源添加剂的辅助，研制具有独立抗菌活性的裂解酶，成为抗生素替代领域需要重点关注的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种源于副溶血弧菌噬菌体编码的裂解酶基因以及体外制备方法。

本发明的技术方法如下：

一种副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidase M15，所述副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidase M15的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

一种编码所述副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidase M15的基因，原始核苷酸序列如SEQ ID No.1，经过大肠杆菌遗传密码偏好性进行优化，优化后的编码裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，即为所述副溶血弧菌裂解酶的编码基因。

一种副溶血弧菌噬菌体裂解酶peptidase M15的制备方法，通过下述方案实现：

S1对副溶血噬菌体vB_VpaM_VPs20所编码的裂解酶的如SEQ ID No.1所示核苷酸序列进行大肠杆菌遗传密码子优化，优化后的裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，即为所述副溶血弧菌裂解酶的编码基因；

S2通过人工合成目的基因进行重组表达载体pCzn1-M15的构建，对重组大肠杆菌Arctic Express-m15的筛选鉴定；

S3对重组大肠杆菌Arctic Express-M15的诱导表达条件进行优化，并对产生的包涵体进行复性后通过Ni柱纯化获得大量正确折叠的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

所述重组表达载体的NdeI和XbaI酶切位点中间插入含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列。所述重组表达载体为原核低温(11℃-37℃)诱导表达载体，具体名称为pCzn1-M15质粒。