[发明专利]一种药用级间充质干细胞及其培养方法

说明书

本申请涉及细胞扩增培养的技术领域，具体公开了一种药用级间充质干细胞及其培养方法，该培养方法包括：将密度为（4‑6）×10⁴个/mL间充质干细胞接种于装有溶胀完全的微载体的生物反应器中，设置生物反应器工艺控制参数，包括温度37℃，pH 7.2‑7.4，溶氧浓度20‑30%以及采用间歇式搅拌方式和持续性搅拌方式结合的搅拌方式，扩增培养，制得药用级间充质干细胞。本申请的培养方法可在不同规模生物反应器中运行稳定，且能够有效扩增间充质干细胞，细胞活率达到90%以上，并符合药用级的标准，可应用于相关的研究及临床治疗中。

技术领域

本申请涉及细胞扩增培养的技术领域，更具体地说，涉及一种药用级间充质干细胞及其培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem/Stromal cell，MSCs)是一种具有自我更新能力、且具有多向分化潜能的原始细胞，来源于发育早期的中胚层。研究表明，间充质干细胞可从骨髓、脐带、脐血、胎盘以及脂肪等组织中提取获得。通过体外扩增培养，可分化为成骨细胞、成软骨细胞以及成脂肪细胞等多种细胞，是组织工程和干细胞治疗的理想种子细胞。临床上的应用包括：改善骨关节炎预后、治疗心梗、修复肺损伤、治疗神经系统疾病和改善高血糖等。

因此，在体外对间充质干细胞进行大规模培养以获得足够数量且高质量的细胞，对于满足临床方面的需求具有重要的意义。传统的体外培养方法主要为2D培养，即使用培养瓶进行培养，细胞贴壁的面积仅为培养瓶的内壁所提供的面积，可供细胞贴壁的面积较小，故在细胞的培养过程中，往往需要消耗的培养瓶数量多、占地面积大，并且需要众多的人力物力，操作繁琐，污染风险大，并且难以保证细胞的一致性及细胞质量。

间充质干细胞呈纤维状，具有贴壁生长的特性。微载体是一种的球体，能够提供较高的比表面积。利用生物反应器进行大规模细胞培养的过程中，通过使用微载体提供贴壁表面，可以改善上述状况。当微载体的使用浓度为10g/L时，可以为1cm³的培养液提供30cm²的生长表面积，从而获得更高的细胞密度。有文献报道，使用微载体在搅拌式生物反应器中培养MSCs 12天，细胞密度最高可达1.7×10⁵个/mL，细胞数量可扩增6倍以上，相当于65个T175培养瓶平面培养获得的细胞。

细胞体外大规模扩增培养需要营养均一和条件可控的生长环境。目前，应用较为广泛的生物反应器包括搅拌罐式生物反应器、波浪式生物反应器、中空纤维式生物反应器和固定床生物反应器。搅拌罐式反应器可以充分传质、传热，使培养液营养成分分布均匀，能够进行过程控制与监测。除了温度(T)、溶解氧(DO)、pH和搅拌速度等控制参数外，使用生物反应器还具有附加的称重功能，还可以使用反应器自带的蠕动泵进行料液转移等操作。这些功能都能促使规模化细胞培养的操作简化，也可以按照需求更改培养工艺。

采用传统的细胞体外大规模扩增培养技术，可以在短期内获得大量的细胞，但不同生产批次细胞的生理代谢水平存在一定的差异，且难以满足药用级细胞的要求，无法直接在临床上应用。

发明内容

为了在短期内获得大量符合药用级要求的间充质干细胞，本申请提供一种药用级间充质干细胞的培养方法及其应用。本申请通过微载体和生物反应器的结合利用，为细胞提供了类似于人体内的生长环境，可以在维持细胞生长速度的同时保证细胞的表型及分化功能正常；进一步对培养过程中的参数进行优化，获得的间充质干细胞可以达到药用级，能够安全地应用于临床的研究及治疗中。

第一方面，本申请提供一种药用级间充质干细胞的培养方法，采用如下的技术方案：

将密度为(4-6)×10⁴个/mL的间充质干细胞接种于装有溶胀完全的微载体的生物反应器中，设置生物反应器工艺控制参数，包括温度37℃，pH 7.2-7.4，溶氧浓度20-30％以及采用间歇式搅拌方式和持续性搅拌方式结合的搅拌方式，扩增培养，制得药用级间充质干细胞；