[发明专利]一种Mb2Cas12a-RRVRR突变体蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因编辑领域，涉及Cas12a蛋白，特别是指一种Mb2Cas12a‑RRVRR突变体蛋白及其制备方法和应用。本研究首次对16种Cas12a蛋白进行了评价，特别是它们在较低温度下的切割活性进行了评估。发现来自Moraxella bovoculi 57922菌株的Mb2Cas12a蛋白活性比其他蛋白更强。此外，本申请在Mb2Cas12a蛋白中引入了5个突变，从而创制Mb2Cas12a‑RRVRR变体蛋白，它具有更广泛的PAMs范围和更强的活性。综上所述，基于CRISPR/Mb2Cas12a‑RRVRR变体的新型检测工具增强了CRISPR技术的诊断能力，有潜力取代现有的Cas12a蛋白。

技术领域

本发明属于基因编辑领域，涉及Cas12a蛋白，特别是指一种Mb2Cas12a-RRVRR突变体蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

近几年，基于Crispr/Cas核酸酶的诊断系统，在农作物病原体检测中得到广泛应用。其中，大多数开发的检测技术主要依赖的原理是：Cas12和Cas13a等Cas蛋白，它们与crRNA组装成二元复合物，特异性识别检测目标后，会对邻近单链DNA/RNA核酸报告分子进行任意切割。一个集成的CRISPR/Cas检测平台需要4步骤，即目标预扩增，通过Cas/crRNA复合体识别目标，Cas蛋白激活和报告分子裂解。Cas12a可以被dsDNA/ssDNA靶标激活，非特异性切割ssDNA，而Cas13可以被ssRNA靶标激活并裂解ssRNA报告分子。通过编程Cas/crRNA识别的序列，各种诊断系统如SHERLOCK和DETECTR被开发并广泛应用于病毒、病原微生物和其他小分子的检测。

虽然现有的CRISPR/Cas12检测系统非常灵敏，结合等温扩增技术可达到aM的检测水平，但是在方法学上仍然有进一步改进的潜力。早期的CRISPR诊断平台通常需要30分钟或更长时间，然而现场检测需要缩短等待时间。此外，Cas12a蛋白需要恒温加热37℃才能有效维持蛋白活力，这可能会给现场应用带来不便。另一个限制是，目前的Cas12a蛋白偏好识别常规的TTTV（V=A，C，或G)的PAM（Protospacer adjacent motif）序列，在识别其他非常规PAMs方面表现出非常低的活性，这限制了crRNA的范围。到目前为止，只有少数的Cas12a蛋白被评估并用于检测系统的开发。然而，来自不同微生物菌株的Cas蛋白具有不同的识别效率和裂解活性。因此，筛选新的Cas12a蛋白是建立更有效的CRISPR/Cas诊断工具的重要手段；专利201811588275.6公开了一种CRISPR/Cas12a基因编辑系统及其应用，该专利从微生物中筛选了具有内切酶活性的LiCas12a蛋白，建立了CRISPR/LiCas12a基因编辑系统，用于在哺乳动物和大肠杆菌中进行基因编辑；专利201911106924.9中公开了识别TTTV、TTV双PAM位点的Cas12a蛋白，该蛋白虽然可以识别TTV PAM位点，但是识别体系的温度偏高；为了进一步寻找可以针对松弛的PAMs的新型Cas12a蛋白，并进一步加快检测过程，特别是在较低的环境温度下也能使用。本课题组进行了长期的摸索研究。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出一种Mb2Cas12a-RRVRR突变体蛋白及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种Mb2Cas12a-RRVRR突变体蛋白，所述Mb2Cas12a-RRVRR突变体蛋白是由Mb2Cas12a蛋白的第172、563、569、573、625位的氨基酸发生突变得到的。

进一步的，所述第172、569、573和625位的氨基酸均突变为R，第563位氨基酸突变为V。

进一步的，所述Mb2Cas12a蛋白选自 Moraxella bovoculi菌株。