[发明专利]一种基于LC-MS/MS法同时测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法

权利要求书

1.一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取系列浓度的多粘菌素E1和多粘菌素E2分别与人空白血清混合，得到样品血清；

2)对样品血清预处理；

3)将预处理后的样品血清注入LC-MS/MS进样分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的样品血清预处理包括以下步骤：

1)取样品血清与含内标的蛋白沉淀剂，按体积比例为1:2于离心管中混合，涡旋混匀5min，置于4℃离心机以12000rpm转速离心6min；

2)取出上清液与0.1％甲酸水，按体积比例为1:2混合。

3.根据权利要求2所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的含内标的蛋白沉淀剂为蛋白质沉淀剂内加入内标溶液得到的。

4.根据权利要求3所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的内标溶液为多粘菌素B110μg/mL的甲醇水溶液，继续用含0.1％甲酸的乙腈稀释成多粘菌素B浓度为1μg/mL的内标工作液。

5.根据权利要求3所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的蛋白沉淀剂为含0.1％甲酸的乙腈溶液。

6.根据权利要求5所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的含0.1％甲酸的乙腈的蛋白沉淀剂为人空白血清或待测人血清体积的2倍。

7.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的LC-MS/MS进样分析采用内标定量法，以多粘菌素E1或多粘菌素E2和内标多粘菌素B1的色谱面积比为纵坐标Y轴，以人血清中多粘菌素E1或多粘菌素E2的浓度为横坐标X轴，建立标准曲线，根据标准曲线计算出待测人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2的浓度。

8.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的建立的标准曲线，多粘菌素E1的代表性标准曲线Y＝0.00126X+0.00854(R＝0.9989)，多粘菌素E2的代表性标准曲线Y＝0.0019X-0.00572(R＝0.9965)。

9.根据权利要求7所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的标准曲线所采用的标品曲线浓度如下：

多粘菌素E1的七个浓度点依次为：50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，800ng/mL,，1600ng/mL，2000ng/mL；多粘菌素E2的七个浓度点依次为：45ng/mL，90ng/mL，180ng/mL，360ng/mL，720ng/mL，1440ng/mL，1800ng/mL。

10.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的LC-MS/MS进样分析采用高效液相色谱，条件如下：流动相A：乙腈；流动相B:含0.1％甲酸水溶液，每个样品采集时间为6min；流速为0.3mL/min，柱温为35℃。

11.根据权利要求8所述的一种基于LC-MS/MS法测定人血清中多粘菌素E1和多粘菌素E2浓度的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱的色谱柱型号：HSST3色谱柱；采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱的方式，0-0.5min，90％-90％B；0.5-2min，90％-40％B；2-2.5min，40％-40％B；2.5-3min，40％-10％B；3.0-4.0min，10％-10％B；4.0-4.5min，10％-90％B；4.5-6.0min，90％-90％B。