[发明专利]一种提高GLP-1 Fc融合蛋白产量的方法

说明书

本发明提供一种提高GLP‑1Fc融合蛋白产量的方法，属于基因工程技术领域，所述方法包括将CHO细胞中的medag基因敲低后得到低表达该基因的稳定细胞株，所述medag基因编码肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白。本发明方法可以显著提高重组蛋白(特别是GLP‑1Fc抗体类)在CHO细胞中的表达水平，对生物制药行业中相关重组蛋白的生产具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，本发明涉及一种提高GLP-1 Fc融合蛋白产量的方法，特别涉及通过在CHO细胞中敲低medag基因揭示该基因与GLP-1 Fc融合蛋白表达之间的密切关系，进而可以通过敲低medag基因达到提高GLP-1 Fc融合蛋白的表达产量，在抗体相关的生物制药领域中具有较好的应用前景。

背景技术

抗体类重组蛋白药物从出现至今凭借卓越的疗效、生物技术的快速发展以及研发投入的不断增加，已成为制药行业近年来发展最快的子行业，近70％的重组蛋白治疗产品都是在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中生产的，CHO细胞对蛋白质的修饰方式与人类细胞相似，因此，利用其生产的治疗性蛋白在临床使用时具有较高的生物活性，这使得CHO细胞在治疗性生物制药工业的发展中起着主导作用。由于哺乳动物细胞的生产周期长、成本高，致使抗体类药物价格高居不下，很多病人因无法负担高昂的费用而失去了最佳治疗时机。因此，为了扩大治疗群体，降低生产成本，大量研究均投入在如何进一步提高CHO细胞的重组蛋白产量上，具体方法包括提高细胞密度，优化表达载体和培养条件，以及对CHO细胞进行基因工程改造等，均取得了明显成效。在过去的几十年中，使用CHO细胞的工业化生产产量从最初的仅约100mg/L，达到后来的克级甚至十几克每升，产量增长上百倍之多。即使如此，仍难满足庞大的市场需求，需要更多能够提高CHO细胞重组蛋白表达的方法和技术。

发明内容

本发明主要提供了一种在CHO细胞中提高GLP-1 Fc融合蛋白产量的方法，即通过敲低细胞内源性medag基因来获得。该基因所编码的蛋白为肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白(mesenteric estrogen-dependent adipogenesis protein)。该蛋白与脂肪细胞的分化、脂肪的积累及葡萄糖摄取相关，但在本说明书中首次发现其在CHO细胞中的敲低可以显著增加GLP-1 Fc融合蛋白的产量，为CHO细胞的基因工程改造提出了新的方法。

具体地，本发明提供了以下方面：

本发明一方面涉及一种提高GLP-1 Fc融合蛋白产量的方法，所述方法包括在CHO细胞中利用CRISPR-Cas9敲低medag基因并得到该基因的低表达细胞株，所述medag基因编码肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白。GLP1-Fc为胰高血糖素样肽1受体激动剂与抗体IgG的Fc融合蛋白。

在本发明的一个优选实施方式中，所述低表达细胞株相比于未敲低medag基因的原始细胞株，medag基因的表达降低20-50％；优选降低25-35％。将medag基因的表达降低到本发明的优选范围内，更有助于GLP-1 Fc融合蛋白产量的提高。

在本发明的一个优选实施方式中，所述medag基因序列如SEQ ID NO：1中所示。

在本发明的一个优选实施方式中，所述medag基因通过含有针对该基因编码区的sgRNA质粒及编码Cas9的质粒共转染到CHO细胞中实现对基因medag的敲低。

在本发明的一个优选实施方式中，所述方法包括利用qPCR与WB对筛选出的细胞株进行medag基因的mRNA表达水平及蛋白表达水平的检测。

本发明另一方面涉及一种CHO细胞，所述CHO细胞低表达medag基因，所述medag基因编码肠系膜雌激素依赖的脂肪形成蛋白。

本发明另一方面还涉及上述CHO细胞在提高重组蛋白的产量中的应用。

在本发明的一个优选实施方式中，所述重组蛋白是GLP-1 Fc融合蛋白。