[发明专利]乳牙间充质干细胞冻存液及其冻存方法

说明书

本发明公开了一种乳牙间充质干细胞冻存液，包括有干细胞基础培养基、血小板裂解物、渗透性保护剂和神经营养类注射液；所述神经营养类注射液为甲钴胺注射液；本发明的乳牙间充质干细胞冻存液可以针对提高干细胞潜在治疗效果的间充质干细胞的冻存液，能够长时间冻存乳牙间充质干细胞，以长时间保持活性和保护细胞；同时又能在细胞冻存液的作用下诱导干细胞的分化，从而提高潜在治疗效果，解冻复苏后，保持较高活性的乳牙间充质干细胞就可以快速投入到临床治疗中，不需要再经过培养基的培养。

技术领域

本发明涉及干细胞冻存技术领域，特别是一种乳牙间充质干细胞冻存液及其冻存方法。

背景技术

干细胞在无菌条件下从人体自身组织中取出，经过分离、纯化后在模拟生理条件下，在体外进行培养，使其不断分化增殖，保持良好的生长状态和增殖活力，然后注入体内。细胞冻存是利用冻存技术将细胞置于-196℃的液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于临床应用。适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时加入冻存液，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

例如中国公开专利CN 110199984 A中，公开了一种脐带间充质干细胞冻存液及其用途，在其实施例二至五中记载了，冻存前后通过流式细胞仪对脐带干细胞进行细胞表面抗原标记表达的分析表明脐带间充质干细胞经该冻存液冻存后表型无明显改变；冻存的脐带间充质干细胞与未冻存的脐带间充质干细胞在体外具有相同的向软骨分化的能力，能力无明显区别；冻存的脐带间充质干细胞与未冻存的脐带间充质干细胞在体外具有相同的向成骨分化的能力，能力无明显区别。

可知，现有的细胞冻存液并不一定能够促进干细胞向其他类型细胞的分化。目前也并无特异性针对提高干细胞潜在治疗效果的间充质干细胞的冻存液。

乳牙间充质干细胞是从儿童乳牙组织中分离出来的间充质干细胞，它具有自我更新、多向分化的能力。而且少量的牙髓间充质干细胞能够通过分裂增殖获得更多的乳牙间充质干细胞。除了生成牙组织细胞，还能“变身”为其他类型细胞，如神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞等，可以用于机体的组织修复。此前的体内研究表明，乳牙干细胞可重建功能性的牙本质/牙髓复合体以及其他组织，如骨头、牙骨质、血管和神经组织，并且经过广泛的研究，除了牙科疾病，乳牙干细胞对各种系统性疾病如脊髓损伤、帕金森氏症、拥有同样的医用价值。

乳牙间充质干细胞能够分化为如神经细胞、肌肉细胞、软骨细胞等，可以用于机体的组织修复。但促进乳牙间充质干细胞的分化培养大多是采用专门的体外培养基。例如中国公开专利CN 108753710 A中，记载了一种无血清完全培养基及其应用，包括依次或混合使用的以下两种培养基：其中，培养基I是在基础培养基中添加L-谷氨酰胺、1％-4％能有效促进细胞粘附和扩展的血清替代物，L-谷氨酰胺的浓度为2mM/L；培养基II是在基础培养基中添加L-谷氨酰胺、7％-10％用于培养ESC和iPSC的血清替代物，L-谷氨酰胺的浓度为2mM/L。本发明还提供了所述无血清完全养基在培养间充质干细胞中的应用。本发明所使用的培养基成分简单配制简便，提供的乳牙间充质干细胞培养方法有利于体外培养人乳牙间充质干细胞，维持干细胞的“干性”及多向分化能力。

但是这种专门的培养基来培养乳牙间充质干细胞的方式不利于长期保存乳牙间充质干细胞，只能在短时间内培养乳牙间充质干细胞，促使其分化，如果长时间培养会存在培养时细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，且培养时间较长，可能会导致离体的乳牙间充质干细胞的活性降低的问题。