[发明专利]一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。利用本发明设计的sgRNA组，对绵羊DYA基因进行编辑，发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，对DYA基因编码的蛋白质结构和功能造成较大破坏。实验结果表明：在目标区域可造成不同片段长度的基因编辑，1号外显子总体编辑效率达到76.4％，2号外显子总体编辑效率达到84.09％。基因组中的两套染色体上均发生编辑(即纯合子)：1号外显子纯合子编辑效率为30.9％；2号外显子纯合子编辑效率为9.1％。本发明提供的sgRNA组在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术为目前最常用的基因编辑技术，此前所用的同源重组、ZFN(锌指核酸酶)、TANLEN(转录激活样效应核酸酶)等技术也可以实现目的基因的大片段精确敲除，但细胞内自然发生同源重组的效率极低。ZFN、TALEN技术的设计繁琐，成本更高且效率较低，而CRISPR/Cas9技术的基因编辑效率较高，并可以介导同源重组，相比于ZFN和TALEN，Cas9系统更具优势。利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，需要首先根据基因组序列设计Sg(single-guide，单链引导)序列，目标基因中一般可设计多个sg序列，但序列的位置碱基顺序会对其编辑靶基因的效率有影响，使用高编辑效率的sg序列更容易获得目标基因编辑的细胞或受精卵，减少获得基因编辑细胞或动物个体的实验时间及成本。

DYA(MHCclassIIantigenDYalpha)基因即MHCII类抗原DYα。DYA基因仅在反刍类动物淋巴组织，皮肤组织和脾脏等组织中表达，DYA表达的蛋白主要位于树突状细胞表面，在免疫应答过程中发挥重要作用。DYA在反刍动物中表达的特异性及其功能，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。现有报导中，没有针对绵羊DYA基因进行编辑的报道，没有针对DYA基因使用CRISPR/Cas9系统实现编辑的实例。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。本发明提供的sgRNA组可以利用CRISPR/Cas9技术对绵羊DYA基因进行编辑，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组，所述sgRNA组包括Exon1-sgRNA和/或Exon2-sgRNA；

所述Exon1-sgRNA包括Exon1-sgRNA1和Exon1-sgRNA2；

所述Exon1-sgRNA1包括Exon1-sgRNA1-F和Exon1-sgRNA1-R；所述Exon1-sgRNA2包括Exon1-sgRNA2-F和Exon1-sgRNA2-R；

所述Exon1-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Exon1-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Exon1-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Exon1-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述Exon2-sgRNA包括Exon2-sgRNA1和Exon2-sgRNA2，所述Exon2-sgRNA1包括Exon2-sgRNA1-F和Exon2-sgRNA1-R；所述Exon2-sgRNA2包括Exon2-sgRNA2-F和Exon2-sgRNA2-R；

所述Exon2-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Exon2-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；