[发明专利]一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法，本方案通过文献对比确定ZET4的活性中心，再通过AutoDock Vina将PLD(2ZE4)分别与底物PC和L‑ser进行分子对接，确定底物分子与酶分子的绑定位点，进行蛋白突变设计，对Y135A、Y135I、T181A、T181I、Q387A、Q387I、D392A、D392I和T194I点位进行单点突变或者两组组合突变，其中T181I、Q387A和Q387I构建的突变菌株的PS产率有所提高，由27.46％提高至30.11％、36.71％、36.90％；突变菌株T194I磷脂酶D的PS产率最高，高达58.32％，相同反应条件下与原始菌株磷脂酶D相比提高了112％；突变体T194I+Q387A和T194I+Q387I的PS产率达到71.24％和73.20％，与WT相比分别提高了159％和167％，与T194I(PS产率为58.32％)相比分别提高了22.15％和25.51％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法。

背景技术

磷脂(Phospholipids)是含有磷酸基化合物的统称，分子结构由2条疏水长碳链和1个极性头部组成。磷脂最早被发现于蛋黄中，是生命体细胞膜的主要组成成分，广泛分布于动植物的各种细胞组织内，承担着信号传导和促进新陈代谢的重任。磷脂的主要生理活性功能是由它的极性头部决定的，根据极性头部的种类，磷脂可以被分为：磷脂酰胆碱(Phatidylcholine，PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylerhanolamine，PE)、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)等。虽然磷脂在自然界分布广泛，种类繁多，但是这些磷脂在自然界中分布却十分不均匀。其中，PS是存在于细胞膜上必不可少的活性物质，可以调控膜蛋白可以被人体快速吸收，高效穿越脑血屏障，安全地减缓甚至修复人脑中神经细胞的受损细胞膜。从而达到改善患者认知能力，学习能力和记忆能力的功效，对阿尔兹海默症的治疗具有一定的辅助作用。主要从大豆中提取获得，也存在于大脑细胞和花生中。在动物中，PS主要存在于大脑和肝脏的细胞中，由于动物容易染病使产品的安全性受到了威胁；在植物中，磷脂含量较多的是PC，相对而言，PS的含量很少，提取困难。所以，利用酶转化法合成PS应运而生，具有操作稳定、高度专一性等优势。

磷脂酶D(PLD)是特殊的磷脂水解酶，能够催化磷脂水解，释放原来磷脂的极性头部，生成磷脂酸(PA)。此外，在含有第二底物(亲核试剂，如丝氨酸，乙醇胺，甘油等)条件下，磷脂酶D能够催化裂解磷脂磷酸二酯键发生断裂，并促进磷酰基与亲核试剂结合，生成新的磷脂。PLD催化的磷脂酰基转移反应是目前使用最为广泛，也是最有效的PS人工合成方法。

但是，目前已知的PLD磷脂酰基转移活力，反应选择性和稳定性都有待提高。

发明内容

本发明意在提供一种提高磷脂酶D合成PS活性的理性定向进化方法，以提高磷脂酶D合成PS的活性。

为达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种磷脂酶D的突变蛋白，对磷脂酶D的氨基酸序列进行点突变，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；所述突变的点位为：Y135A、Y135I、T181A、T181I、Q387A、Q387I、D392A、D392I、和T194I的一个或多个组合。

本发明还提供了一种表达上述突变蛋白的重组菌。

优选的，作为一种改进，所述重组菌的基础菌株包括大肠杆菌。

本发明还提供了上述重组菌的构建方法，包括以下步骤：