[发明专利]鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗及应用。本发明构建的CHO稳定表达细胞株具有产量高、稳定性好、易于规模化生产等优点。本发明构建了QX‑RBD‑YFc和GⅥ‑RBD‑Yfc蛋白的二联亚单位疫苗，同时构建了表达这两个蛋白的细胞系。QX‑RBD‑YFc蛋白、GⅥ‑RBD‑YFc蛋白能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，这两个蛋白使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到1‑2g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及鸡传染性支气管炎二价亚单位疫苗及应用。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBV属于Nido病毒目(Ni dovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)中第三群的成员。病毒基因组由单股不分节段的正链RNA组成，长约27.6kb.含有4种结构蛋白，即纤突(Spike，S)糖蛋白、核衣壳(Nucleocapsid，N)蛋白、膜(Membrane，MD糖蛋白和小膜(Sma11Envelope，E)糖蛋白。IBV基因组3'端和5'端都有非编码区(UTR)，与病毒的复制和转录有关，可与病毒复制酶和潜在的其他宿主蛋白相互作用【3】。5'端帽状结构后有长约60～70个核昔酸的先导序列，紧接着是病毒编码的复制酶基因，覆盖了病毒基因组的三分之二，并被翻译成多聚蛋白la和lab，这两种多聚蛋白通过自身蛋白水解活性被切割成15种非结构蛋白(nsp2-16)，Jackwood等对每种蛋白的功能进行了描述【4】。3'端约1/3的结构基因编码4种结构蛋白，即纤突蛋白(Spike protein，S)、膜蛋白(Membrane protein，M)、小膜蛋白(Envelopeprotein，E)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)。S蛋白决定了冠状病毒典型的冠状特征，翻译后被碱性蛋白酶裂解为S1和S2两个亚单位。S1亚基来源于s蛋白的N端部分，包含至少2个与宿主受体结合的结构域(RBD)，负责病毒与宿主细胞的结合【5】，此外，S1亚基还具有诱导产生中和抗体的抗原表位【6】。S2亚基通过跨膜结构域镶嵌入病毒囊膜中，与S1亚基非共价连接，并将其锚定在病毒粒子上，S2亚基含有一个内部融合肽和两个七肽重复序列，是病毒融合的基础【7】。直到2016年Viviana等基于S1基因全长序列确定了GI-GVI等6个基因型，其中GI基因型包括27个亚型【8】。

针对鸡传染性支气管炎病毒，现有疫苗几乎均为全病毒灭活疫苗或者活疫苗，也存在一些亚单位疫苗比如CN 109985235 A中所公开的鸡传染性支气管炎基因工程亚单位疫苗，使用中国仓鼠卵巢细胞CHO-S细胞共表达IBV-S1蛋白和S2蛋白，S1蛋白和S2蛋白之间能够形成异二聚体结构，和病毒表面结构类似，能够激发中和抗。专利中所使用的氨基酸序列SEQ ID NO:3经过NCBI的blast比较与QDA76309.1(strain＝M41)的相似性为100％,使用的另一个氨基酸序列SEQ ID NO:4的序列比对结果为与QWC71247.1(strain＝IBV/M41/Y191)的相似性为99.28％。两氨基酸序列均为M41毒株S蛋白。

M41均属于GI基因型种的GI-1基因亚型。已知IBV容易变异且血清型较多，各血清型毒株间交叉保护性较弱，因此开发符合流行毒株血清型的疫苗和建立相应的免疫效果评价方法具有十分重要的意义。近年来QX型已经成为亚洲及欧洲流行的主要血清型之一，占我国流行毒株分离鉴定毒株总数的70％以上