[发明专利]一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产2’‑岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。本发明提供了一株产2’‑岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，构建了一条高效的2’‑岩藻糖基乳糖合成路线，利用从头合成途径合成足够多的GDP‑L‑岩藻糖。然后对染色体基因wcaj、nudD和nudK进行基因敲除，并在wcaj位点插入futCB基因，futCB酶催化GDP‑L‑岩藻糖合成2’‑岩藻糖基乳糖的活性非常高，可大量提高2’‑岩藻糖基乳糖的产量。经验证，摇瓶产量达到8.4g/L，上罐发酵产量达到85g/L，实现2’‑岩藻糖基乳糖的大量生产。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

母乳低聚糖(human milkoligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质，在母乳中的含量约为15％。现有的研究表明，母乳低聚糖对新生儿有许多重要的影响，实际生活中，常常出现不能使用母乳进行喂养的情况，此时一般会使用婴儿配方奶粉进行替代。目前，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)正式批准将母乳低聚糖用作婴儿配方奶粉中的新型食品添加剂。因此，工业合成2’-岩藻糖基乳糖(2‘FL)并提高产量降低生产成本已经成为目前的研究热点。

现有的工业生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法以大肠杆菌作为工程菌，在提供碳源的前提下，利用大肠杆菌内的基因通路，合成2’-岩藻糖基乳糖的前体物质GDP-L-岩藻糖和受体乳糖，并且向工程菌中转入外源的α-1,2-岩藻糖基转移酶，将两个前体结合，从而工业合成2’-岩藻糖基乳糖。生物合成法需要供体GDP-l-focus、受体乳糖和α-1,2-focusyltransferase(FT)的持续供应。其中，乳糖作为一种低廉的底物，一般可以被野生型生产者自身同化和降解，这会导致工程菌的乳糖利用率下降。

GDP-L-岩藻糖是合成2’-岩藻糖基乳糖的关键前体，可以通过两种途径合成。一种是源自colanic acid生物合成的大肠杆菌中自然存在的途径。从中枢代谢中的果糖6-磷酸开始，通过5个酶促步骤(ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG)转化为GDP-L-岩藻糖。另一个是最初来源于真核细胞的补救途径，这需要昂贵的L-focuse作为底物和来自fragilis(B.fragilis)的催化酶Fkp来产生GDP-L-岩藻糖。出于成本考虑，一般选用从头合成途径合成GDP-L-岩藻糖。假如参与可拉酸生物合成的wcaj基因失活，或者阳性调控基因RcsA过表达，均可以增加细胞内的GDP-L-岩藻糖的量，但这一途径中某些中间产物(如GDP-甘露糖)的缺乏，仍可能降低GDP-L-岩藻糖的合成量。由于GDP-L-岩藻糖是合成2’-岩藻糖基乳糖重要的前体物质，如何让合成途径中GDP-L-岩藻糖的量增多是现阶段要解决的技术难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌及其构建方法和应用，利用从头合成途径合成足够多的GDP-L-岩藻糖，实现2’-岩藻糖基乳糖的大量生产。

本发明提供了一株产2’-岩藻糖基乳糖的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)利用futCB基因替换大肠杆菌Jm109(DE3)基因组中的wcaJ基因，并敲除LacZ、nudD和nudK基因，得E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK；

(2)利用重组载体转化步骤(1)所述E.Coli.Jm109(DE3)：：futCBΔZDK，得重组工程菌；

所述重组载体以pRSFDuet-1为基础载体，并插入GW基因片段和CB基因片段，所述GW基因片的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CB基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，步骤(1)中，敲除wcaJ基因所用的引物包括wcaJF和sgRNAR，其中wcaJF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，sgRNAR的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；