[发明专利]一种mRNA纯化方法

说明书

本发明公开了一种mRNA纯化方法。所述mRNA纯化方法包括：将待纯化mRNA与硫酸铵混合，收集沉淀，得到纯化mRNA。本发明创造性地利用硫酸铵沉淀方法对mRNA进行纯化，纯化条件范围广，纯化过程稳定，易于放大到工业化规模生产中，同时安全性高且得到的mRNA收率高。

技术领域

本发明属于核糖核酸分离纯化技术领域，涉及一种mRNA纯化方法。

背景技术

随着mRNA疫苗对流感病毒、寨卡病毒和狂犬病毒的有效免疫，特别是在SARSCoV-2的mRNA疫苗研究之后，mRNA成为目前研究重点。非复制性信使RNA大规模生产主要以线性化的质粒DNA为模板，NTP为原料，在镁离子和亚精胺的辅助下，通过RNA聚合酶进行体外酶促转录反应合成目标mRNA，但mRNA极易发生降解，为了提高其稳定性和翻译效率，需要对转录得到的mRNA进行5’端加帽和3’端加尾。

目前常用的mRNA纯化方法包括沉淀法、色谱法和膜过滤法。常用的色谱法包括离子交换、OligodT亲和层析，纤维素层析，反相离子对色谱层析等。其分离精度高，但需要mRNA与其他杂质在电荷、尺寸等方面存在一定差异，才具有纯化的可能性，而且对于不同序列、长度的mRNA，需要探索不同的层析原理，往往需要多种层析模式的组合，操作时间长。此外，介质的价格成本较高，尤其是dT亲和介质，不仅载量有限，配基价格也较高，更适合于后面的精纯步骤。膜分离法虽然分离速度快，但强烈的剪切容易导致产物被破坏，分离精度也有限。

与层析分离和膜分离相比，沉淀分离具有操作简便，易于规模放大，收率高的优势，而且mRNA产物在沉淀中更为稳定，还可以作为中间产物储存起来，对于大规模生产过程更有优势。目前实验室常用于mRNA沉淀的沉淀剂包括氯化锂、醋酸铵/醋酸钠、氯仿-异丙醇法等，在对mRNA进行粗纯的同时可以对mRNA进行浓缩。氯化锂沉淀是实验室规模最常用的沉淀方法，但是氯化锂沉淀法需要在-20oC低温下进行操作，能耗高；此外，氯化锂属于低毒类试剂对眼睛和粘膜有刺激和腐蚀作用，样品中残留的锂盐对人来中枢系统产生危害，因此这种方法在使用中存在局限性。醋酸铵和醋酸钠等沉淀法也需在低温下进行。氯仿-异丙醇法沉淀使用大量有机试剂，同样对后续研究会产生生物危害性。

CN115287282A公开了一种mRNA工业化分离纯化方法及其应用，所述方法包括：将mRNAIVT反应液依次进行亲和层析和疏水层析处理，得到纯化的mRNA。此方法将亲和层析和疏水层析两步法纯化工艺用于mRNA产品的纯化，操作易放大，提高了纯化mRNA的总回收率。但此方法存在溶剂耗费量大，价格成本高等问题。

CN114907430A公开了一种mRNA的分离纯化方法，所述方法包括：(1)将待分离纯化的mRNA原料进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，收集穿透组分，吸附组分弃去或重复利用；(2)将穿透组分进样至疏水层析柱中，用平衡缓冲液冲洗疏水层析柱，后用流动相进行洗脱，根据260nm处的紫外吸收信号，收集mRNA组分。此方法得到的mRNA回收率高，纯度高，能在室温下进行操作，易于放大到工业化规模生产。但此方法对mRNA的性质要求高，适用性局限，操作复杂。

综上所述，目前mRNA纯化方法存在操作复杂，成本高，会产生生物危害性等问题。如何提供一种安全性高、可常温进行、高收率的mRNA纯化方法，已成为目前核糖核酸分离纯化技术领域亟待解决的问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种mRNA纯化方法，解决了目前mRNA纯化方法操作复杂、安全性低和成本高等问题，实现了简单、高效地获得高纯度和高收率的mRNA，易于规模放大应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种mRNA纯化方法，所述mRNA纯化方法包括：

将待纯化mRNA与硫酸铵混合，收集沉淀，得到纯化mRNA。