[发明专利]雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法的方法，属于植物基因工程技术领域，所述方法步骤如下：选取雪莲种子，加赤霉素浸泡过夜；消毒，然后置于MS0培养基上培养，得到的雪莲的无菌苗，将无菌苗剪碎置于愈伤诱导培养基诱导出愈伤，将愈伤切碎；置于3/4MS愈伤诱导水培培养基中，获得悬浮愈伤系，将悬浮愈伤系浸泡到制备好的侵染液，然后转移到筛选培养基3/4MS培养基诱导愈伤1个月；将新长出的愈伤转移到分化筛选培养基3/4MS诱导再生芽3‑4个月，再转移到MS0生根培养基生根2‑3周；本发明首次将雪莲的遗传转化体系提高到85％以上，本发明在雪莲的遗传转化过程中全程使用GFP荧光蛋白进行实时监控，为基因工程改造雪莲，创制高产优质雪莲细胞系，推动雪莲的资源利用奠定基础。

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，植物高效遗传转化技术领域，尤其涉及雪莲遗传转化及相关基因工程材料的获得。

背景技术

雪莲是菊科凤毛菊属多年生高山植物，是珍稀濒危禁采的中草药资源，含有丰富的天然活性物质，性温、微苦，具有温肾助阳、祛风胜湿、通经活血等功效。由于天山雪莲生长环境特殊，4到5年开花，自然繁殖率低，生长缓慢，致使其很难通过育种和栽培技术获取雪莲资源。

结合现在多数研究总结，雪莲的遗传转化方法集中在农杆菌介导农杆菌，外植体的选择是叶片愈伤、种子愈伤、叶片，这些转化材料的选择都存在这转化效率低、资源受限的问题。植物的悬浮细胞为均一性、分散性良好且生长旺盛，是进行遗传转化非常优良的受体，目前没有雪莲悬浮细胞系遗传转化的报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法，以悬浮愈伤细胞为转化受体，解决了雪莲资源稀缺的问题，筛选出适合雪莲的不同生长阶段的培养基，确定筛选标记以及适合的筛选量，首次使用了GFP荧光蛋白在雪莲愈伤中时时监控，并且也是首次将雪莲的遗传转化体系提高到85％以上，为基因工程改造雪莲，推动雪莲的资源利用奠定基础。

为了实现上述发明的目的，本发明提供了一下技术方案：

一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法的方法，步骤如下：

(1)选取颗粒饱满的雪莲种子，加300mg·L^-1GA3浸泡雪莲种子过夜；

(2)第二天将种子置于8-12％的次氯酸钠浸泡10-20min，无菌水冲洗，然后泡在0.5-1.5％的过氧化氢溶液48h；

(3)取出种子晾干，将种子置于MS0培养基，在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养30-40d；所述的MS0培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，4g·L^-1植物凝胶，pH值为6；

(4)等到雪莲种子发芽后，选取已经确定的无菌苗置于MS0培养基，在24℃下，光周期为8h光照，16h黑暗，培养30-40d；

(5)将得到的雪莲的无菌苗，待无菌苗长到6-8cm，将苗子剪碎约0.5-1cm的正方形；置于愈伤诱导培养基3/4MS，在24℃下，暗培养；所述3/4MS培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1植物凝胶，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–16-BA，pH值为6；

(6)雪莲25-30d长出愈伤，将新长出的愈伤从雪莲叶片上剥离下来，用手术刀将愈伤切碎；将切好的愈伤置于加入100mL3/4MS愈伤诱导水培培养基中250mL的摇瓶中，在24℃下，黑暗培养40-50d；所述3/4MS水培培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，pH值为6；