[发明专利]雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化方法

权利要求书

1.一种雪莲细胞的快速悬浮培养和遗传转化的方法，其特征在于，所述方法步骤如下：

(1)选取颗粒饱满的雪莲种子，加300mg·L^-1赤霉素浸泡雪莲种子过夜；

(2)第二天将种子置于8-12％的次氯酸钠浸泡10-20min，无菌水冲洗，然后泡在0.5-1.5％的过氧化氢溶液48h；

(3)取出种子晾干，将种子置于MS0培养基，在24℃下，光周期为16h光照，8h黑暗，培养30-40d；所述的MS0培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，4g·L^-1植物凝胶，pH值为6；

(4)等到雪莲种子发芽后，选取已经确定的无菌苗置于MS0培养基，在24℃下，光周期为8h光照，16h黑暗，培养30-40d；

(5)将得到的雪莲的无菌苗，待无菌苗长到6-8cm，将苗子剪碎约0.5-1cm的正方形；置于愈伤诱导培养基3/4MS，在24℃下，暗培养；所述3/4MS培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1植物凝胶，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–16-BA，pH值为6；

(6)雪莲25-30d长出愈伤，将新长出的愈伤从雪莲叶片上剥离下来，用手术刀将愈伤切碎；将切好的愈伤置于加入100mL3/4MS愈伤诱导水培培养基中250mL的摇瓶中，在24℃下，黑暗培养40-50d；所述3/4MS水培培养基是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，pH值为6；

(7)后续雪莲水培愈伤进入快速期，每隔15天继代一次；

(8)提前制备侵染液：冻融法将质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD₆₀₀＝0.4-0.5时加入乙酰丁香酮终浓度为100μmol·L^–1，2h后离心富集菌液，使用3/4MS侵染液重悬为OD₆₀₀＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述3/4MS侵染液是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(9)将悬浮愈伤系浸泡到制备好的侵染液中里，同时真空抽滤10min，超声5min，抽真空10min，后将水培愈伤用滤纸晾干，于超净台中吹约1-2h，置于共培养培养基3/4MS AS共培养两天；所述共培养培养基3/4MS AS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，4g·L^-1植物凝胶，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(10)将悬浮愈伤转移到筛选培养基3/4MS培养基诱导愈伤1个月；所述筛选培养基3/4MS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–16-BA，4g·L^-1植物凝胶，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1，pH值为6；

(11)将新长出的愈伤转移到分化筛选培养基3/4MS诱导再生芽3-4个月；所述分化筛选培养基3/4MS是在MS含量0.75倍基础培养基中，含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，0.1mg·L^–1NAA，3mg·L^–16-BA，4g·L^-1植物凝胶，300mg·L^–1特美汀，1mg·L^–1草铵膦，pH值为6；

(12)将诱导出来的芽转移到MS0生根培养基生根2-3周；所述的MS0生根培养基是在MS含量减半的基础培养基中，含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，0.3mg·L^–1NAA，4g·L^-1植物凝胶，pH值为6。

2.利用权利要求1所述方法对雪莲进行转基因的应用。