[发明专利]一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒，包括DNA纳米机器溶液N1～N2、锰离子溶液M、CRISPR Cas12a溶液C1～C4和标准溶液。本发明在制备DNA纳米机器溶液后，将待测样品与DNA纳米机器溶液孵育，通过磁分离获取上清液进行CRIPSR Cas12a信号扩增反应，实现癌胚抗原的定性检测，解决了目前操作繁琐、仪器设备要求高、发光时间短、检测样本受限等缺点，难以满足快速定性检测及早期筛查要求的问题。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法。

背景技术

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一种广谱肿瘤标志物，作为一种分子量为200kDa的糖蛋白，与结直肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和甲状腺髓样癌直接相关。健康成人中CEA的正常水平约为3.0–5.0ng/mL，高水平的CEA可预示癌症的存在。因此，开发一种灵敏、简便的CEA检测方法具有重要的临床意义。目前，针对CEA的检测方法主要有、酶联免疫吸附测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定等，存在操作繁琐、仪器设备要求高、发光时间短、检测样本受限等缺点，难以满足快速定性检测及早期筛查要求。

针对传统检测方法的局限性和新兴检测方法的有限，利用DNA纳米机器的动态机械能及CRIPSR Cas12a的核酸剪刀、级联放大信号功能，开发简便、快速的CEA检测试剂盒，通过有无荧光信号定性判读血清样品中CEA含量，筛查高水平CEA含量人群，实现肿瘤的早期筛查的目的，本发明提出了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法，解决了目前操作繁琐、仪器设备要求高、发光时间短、检测样本受限等缺点，难以满足快速定性检测及早期筛查要求的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒，包括DNA纳米机器溶液N1～N2、锰离子溶液M、CRISPR Cas12a溶液C1～C4和标准溶液。

本发明还提供一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，包括以下步骤：

S1、制备DNA纳米机器溶液N1；

S2、制备DNA纳米机器溶液N2；

S3、制备锰离子溶液M与CRISPR Cas12a溶液C1～C4；

S4、CEA检测：

1)、取待测溶液与DNA纳米机器溶液N1、DNA纳米机器溶液N2，37℃孵育15min后加入锰离子溶液M；

2)、37℃孵育60min后磁分离，收集上清液，加入C1、C2、C3、C4，继续37℃孵育5min；

3)、于手提紫外下观测荧光并于荧光分光光度计测量荧光光谱。

进一步的，S1中N1的具体制备方法如下：

1)、取500μL氯金酸(1％，w/v)与52mL去离子水剧烈搅拌并加热至沸腾，迅速加入1％的2mL柠檬锰酸三钠混合液(含0.05％柠檬酸，w/v)，继续加热剧烈搅拌5min使溶液颜色变为酒红色，冷却至室温后得到金纳米粒子，4℃保存备用；

2)、取15μL Walker DNA(10μM)序列与15μL适配体DNA(30μM)序列、20μL PBS(10mM)缓冲液混合，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟，室温条件下孵育60min后，加入1mL制备的金纳米粒子溶液中，混匀过夜后，加入浓度5M的NaCl老化并放置24h，12000rpm离心20min去除未结合的DNA序列，重悬于浓度为10mM的PBS溶液中，制备得到DNA纳米机器溶液N1。

进一步的，S2中N2的具体制备方法如下：