[发明专利]一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测试剂盒，其特征在于：包括DNA纳米机器溶液N1～N2、锰离子溶液M、CRISPR Cas12a溶液C1～C4和标准溶液。

2.一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、制备DNA纳米机器溶液N1；

S2、制备DNA纳米机器溶液N2；

S3、制备锰离子溶液M与CRISPR Cas12a溶液C1～C4；

S4、CEA检测：

1)、取待测溶液与DNA纳米机器溶液N1、DNA纳米机器溶液N2，37℃孵育15min后加入锰离子溶液M；

2)、37℃孵育60min后磁分离，收集上清液，加入C1、C2、C3、C4，继续37℃孵育5min；

3)、于手提紫外下观测荧光并与荧光分光光度计测量荧光光谱。

3.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：S1中N1的具体制备方法如下：

1)、取500μL氯金酸(1％，w/v)与52mL去离子水剧烈搅拌并加热至沸腾，迅速加入1％的2mL柠檬锰酸三钠混合液(含0.05％柠檬酸，w/v)，继续加热剧烈搅拌5min使溶液颜色变为酒红色，冷却至室温后得到金纳米粒子，4℃保存备用；

2)、取15μL Walker DNA(10μM)序列与15μL适配体DNA(30μM)序列、20μL PBS(10mM)缓冲液混合，95℃加热5分钟，4℃冷却5分钟，室温条件下孵育60min后，加入1mL制备的金纳米粒子溶液中，混匀过夜后，加入浓度5M的NaCl老化并放置24h，12000rpm离心20min去除未结合的DNA序列，重悬于浓度为10mM的PBS溶液中，制备得到DNA纳米机器溶液N1。

4.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：S2中N2的具体制备方法如下：

1)、取1.62g氯化铁溶于60mL乙二醇，室温下剧烈搅拌至完全溶解后加入2.7g醋酸钠和0.1839g SDS，继续室温剧烈搅拌至完全溶解，随后转移到反应釜中200℃反应12h，冷却至室温后，沉淀物于乙醇和去离子水中交替冲洗3次，于真空干燥箱中烘干，得到DNA纳米机器溶液N2的磁性核心Fe3O4纳米粒子；

2、)取10mg Fe3O4，用甲醇冲洗三次，加入2mL PEI-KOH-CS2溶液，混匀后静置1h，冲洗后分散于4mL去离子水中，再加入30mL金种子溶液，室温下剧烈搅拌1h，得到DNA纳米机器溶液N2的复合纳米材料；

3)、将1mg/mL的Fe3O4@Au与10μL Track DNA(100μM)混合后室温孵育过夜，磁分离去除未结合DNA序列，重悬于浓度为10mM的PBS溶液中，制备得到DNA纳米机器溶液N2。

5.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：S3中锰离子溶液M制备方法为：称取MnCI2·4H2O 1.98g加入1LDEPC处理水，制备为10mM锰离子溶液M。

6.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：S4中具体检测计量如下：待测溶液100μL、DNA纳米机器溶液N15μL、DNA纳米机器溶液N2 25μL、锰离子溶液M 20μL、C1 3μL，C2 2μL、C3 4μL、C4 1μL。

7.根据权利要求2所述的一种级联信号放大的癌胚抗原定量检测方法，其特征在于：CRISPR Cas12a溶液C1～C4分别为：C1为50nM Cas12a蛋白酶、C2为50nM crRNA序列、C3为酶切缓冲液，C4为20μM报告探针溶液。