[发明专利]重组神经元特异性烯醇化酶及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种重组神经元特异性烯醇化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括对发酵液进行纯化的步骤，所述发酵液含有大肠杆菌，所述大肠杆菌已被诱导表达重组神经元特异性烯醇化酶，所述纯化的步骤包括：

将所述发酵液固液分离，获得菌体；

将所述菌体裂解后离心，得到含有重组神经元特异性烯醇化酶的粗上清液；

将所述粗上清液经镍离子亲和层析纯化，得到粗蛋白液；

将所述粗蛋白液经复合阳离子交换层析纯化，得到精蛋白液，其中，所述复合阳离子交换层析的平衡液的pH为5.3～6.8或2.8～4.2，所述复合阳离子交换层析的线性流速为100cm/h～300cm/h，及将所述精蛋白液经凝胶层析纯化，得到纯化后的重组神经元特异性烯醇化酶。

2.根据权利要求1中所述的重组神经元特异性烯醇化酶的制备方法，其特征在于，将所述粗上清液经镍离子亲和层析纯化的步骤包括：

取1mL～2mL镍柱填料于纯化柱中，得到镍离子亲和层析柱；

当所述镍离子亲和层析柱中的乙醇全部滴完后，加入双蒸水和/或超纯水清洗镍离子亲和层析柱；

采用pH为6.0～8.0的镍柱平衡液对所述镍离子亲和层析柱进行平衡，所述镍柱平衡液包括0.01M～0.05MPBS、0.01M～0.05M咪唑、5％～15％的丙三醇及0.1M～0.5MNaCl溶液中的至少一种；

将所述粗上清液上样到平衡后的镍离子亲和层析柱中；

采用浓度为0.02M～0.05M咪唑洗脱液进行洗脱，以去除杂蛋白；及在洗脱杂蛋白后，采用浓度为0.1M～0.5M咪唑洗脱液梯度洗脱，获得粗蛋白液。

3.根据权利要求1所述的重组神经元特异性烯醇化酶的制备方法，其特征在于，所述将所述粗蛋白液经复合阳离子交换层析纯化的步骤包括：

采用纯水对复合阳离子层析柱进行预平衡，所述离子层析柱的填料为复合阳离子交换介质；及采用pH为5.3～6.8的复合阳离子层析平衡液对预平衡后的复合阳离子层析柱进行平衡，所述复合阳离子层析平衡液选自浓度为20mM～50mM PBS、20mM～50mM Tris、20mM～50mM NaAc-HAc中的至少一种；及将所述粗蛋白液上样到所述平衡后的复合阳离子交换层析柱中，收集流穿液，获得精蛋白液。

4.根据权利要求1中所述的重组神经元特异性烯醇化酶的制备方法，其特征在于，将所述精蛋白液经凝胶层析纯化的步骤包括：

采用纯水对凝胶层析柱进行预平衡，所述层析柱的填料为凝胶层析填料Super200；及采用pH为6.0～8.0的凝胶层析平衡液对预平衡后的凝胶层析柱进行平衡，所述凝胶层析平衡液选自浓度为20mM～50mM PBS、20mM～50mM Tris、20mM～50mM NaAc-HAc中的至少一种；及将所述精蛋白液上样到平衡后的凝胶层析柱中，以柱体积为基准，上样量为1％～5％，线性流速为30cm/h～50cm/h，收集流穿液，获得纯化后的重组神经元特异性烯醇化酶。

5.根据权利要求1～4任一项所述的重组神经元特异性烯醇化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对大肠杆菌进行诱导培养以获得发酵液的步骤，所述大肠杆菌含有用于表达重组神经元特异性烯醇化酶的核酸片段。

6.一种重组神经元特异性烯醇化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

7.一种核酸，其特征在于，用于编码权利要求1～6任一项所述的重组神经元特异性烯醇化酶。

8.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求7所述的核酸。

9.一种宿主，其特征在于，其基因组中含有权利要求8所述的重组表达载体。

10.权利要求1～5任一项所述的重组神经元特异性烯醇化酶的制备方法、权利要求6所述的重组神经元特异性烯醇化酶、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的重组表达载体或权利要求9所述的宿主细胞在制备肿瘤标志物诊断试剂中的应用。