[发明专利]玉米氮利用相关基因ZmNLP9的应用

说明书

本申请提供了玉米氮利用相关基因ZmNLP9,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。本发明经过研究发现，在玉米中利用基因编辑技术敲除ZmNLP9基因能够显著提升玉米氮利用效率；本发明提供的ZmNLP9蛋白及其编码基因的这一新应用，为培育耐低氮玉米新品种提供新的种质资源，同时对于研究植物低氮应答响应分子机制和提高植物氮利用效率研究奠定了一定的理论基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及玉米ZmNLP9蛋白及其编码基因在构建耐低氮玉米中的应用。

背景技术

随着世界人口的迅速增加以及生活水平的不断提高，人类的粮食需求快速增加，而化肥的施用以及优良品种的选育，是粮食产量产生质的飞跃的关键因素。但是以氮肥为主的化肥大规模施用会对生态环境造成破坏，而低氮环境广泛存在与我们的耕地之中，氮素营养不存不仅会影响到植物的生长发育，更是制约玉米产量的主要非生物逆境，因此，从分子生物学角度研究玉米如何耐受低氮，了解低氮环境下玉米生理生化变化，对培育玉米耐低氮新品种显得尤为重要。

玉米作为重要的农业作物，其播种面积以及产量高居全国第一，而玉米对土壤氮肥的含量要求较高，且不具有生物固氮的能力，提升玉米的氮利用效率，增强玉米对低氮土地的耐受性，对减少农业支出和减轻环境污染有着重要的意义。研究玉米具体响应低氮胁迫的分子机制和影响其主要生理生化过程中的主效因子，可以通过敲除相关基因在玉米野生型植株中，运用相应实验方法检测该转基因植株较野生型耐低氮能力是否发生变化，能有效的发掘低氮相关的优质基因资源，从而为进一步改善玉米耐低氮能力和培育耐低氮新品种提供一定的理论依据。

发明内容

针对以上情况，本发明通过编码玉米类NIN蛋白的基因ZmNLP9(全称为NODULEINCEPTION LIKE PROTEIN 9)的研究，发现降低该基因表达的转基因植株较野生型植株具有明显耐低氮的表型。

一方面，本申请提供了玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在低氮胁迫抗性植物育种中的应用。

另一方面，玉米氮利用相关基因ZmNLP9，,敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达的试剂在氮高效植物育种中的应用。

另一方面，本申请提供了增强植物对于低氮胁迫抗性的方法，包括敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达。

进一步地，所述ZmNLP9核苷酸序列为SEQ ID NO.10。

进一步地，所述ZmNLP9编码的蛋白序列为SEQ ID NO.9。

进一步地，所述植物为单子叶植物。

进一步地，所述植物为玉米。

进一步地，敲除ZmNLP9或降低ZmNLP9表达使用CRISPR方法进行。

进一步地，所述CRISPR方法包括设计gRNA序列；扩增、回收、构建载体；转入农杆菌；侵染植株。

进一步地，gRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，以pXUE411为模板，使用序列为SEQ ID NO.2-5的引物进行扩增。

构建耐低氮ZmNLP9的CRISPR/Cas9材料的方法，包括以下步骤：

1)利用CRISPR/Cas9靶点设计在线网站crispr-P(http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR/CRISPR)设计并筛选候选靶序列，靶序列通常要求位于CDS的保守功能域内或其上游、GC含量在45％-75％之间；