[发明专利]一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法

说明书

本发明公开了一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法，该重组细胞株表达突变型SHP2蛋白，所述突变型SHP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。构建方法包括如下步骤：(1)将SEQ ID No.1所示的SHP2(T507K)基因克隆到慢病毒载体上；(2)将步骤(1)得到的慢病毒载体转染293T细胞包装成病毒；(3)将步骤(2)得到的病毒感染细胞，筛选阳性后传代，建立稳定表达突变型SHP2蛋白的细胞株。本发明的构建方法得到的细胞株稳定性强，为下游白血病的治疗及药物筛选提供了很好的工具。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法。

背景技术

SHP2(Src-homology containing phosphatase 2)广泛表达于各种组织细胞，并通过Ras-MAPK、JAK-STAT、PI3K/AKT等信号通路在细胞的增殖、分化、迁移以及周期维持等多种细胞功能中发挥重要作用。SHP2是由PTPN11编码的一种非受体蛋白酪氨酸磷脂酶。SHP2在结构上包含两个Src同源-2结构域(即N-SH2和C-SH2)、一个催化结构域(PTP)和一个C-端尾链。静息状态下，N-SH2结构域和PTP结构域上的氨基酸残基之间通过相互作用，使SHP2分子维持在一种非活化的自抑制构象；在细胞因子、生长因子等的刺激作用下，SHP2暴露出催化位点，产生催化活性。

PTPN11的生殖细胞或者体细胞突变引起的SHP2催化功能的高度活化在患有先天性疾病，比如努南(Noonan)综合征、LEOPARD综合征以及血液瘤，比如青少年髓单核细胞白血病、骨髓增生异常综合征、B细胞型急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、急性粒细胞白血病等的病人中都得到确证。此外，PTPN11的活化性突变也存在于比如肺癌、结肠癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和肝癌等多种实体瘤中。同时，SHP2在PD 1/PD L1介导的肿瘤免疫逃逸中也扮演着重要角色。因此，SHP2蛋白在人肿瘤和其他疾病中的活化或上调使其成为发展创新疗法的理想靶标，针对SHP2药物开发已成为未来可期的重要策略。建立一种可稳定表达激活型SHP2细胞株将为疾病的机制及相关领域的基础及临床转化研究具有重要的意义和广阔的应用前景。

与大多数SHP2激活突变不同，SHP2中的T507K突变表现出致癌的Ras样转化活性。T507K取代改变了SHP2底物特异性及其变构调节机制。尽管SHP2/T507K存在于与WT酶相似的封闭的、自抑制的构象中，但其N-SH2和蛋白酪氨酸磷酸酶结构域之间的相互作用减弱，使得SHP2/T407K对支架蛋白Grb2相关结合蛋白1(Gab1)具有更高的亲和力。另外，T507K取代改变了SHP2活性位点的结构，导致SHP2底物对Sprout1的偏好发生变化，Sprout1是已知的Ras信号负调节因子，也是潜在的肿瘤抑制因子SHP2/T507K在底物特异性上的改变及其与Gab1的优先结合使突变SHP2能够更有效地在pTyr-53处去磷酸化Sprout1。这种去磷酸化过度激活Ras信号，这可能是SHP2/T507K的Ras样转化活性的原因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何构建一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株。

本发明的技术方案为：一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株，该重组细胞株表达突变型SHP2蛋白，所述突变型SHP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株的构建方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID No.1所示的SHP2(T507K)基因克隆到慢病毒载体上；

(2)将步骤(1)得到的慢病毒载体转染293T细胞包装病毒；

(3)将步骤(2)得到的病毒感染细胞，筛选后传代，建立稳定表达突变型SHP2蛋白的细胞株。

进一步地，构建方法包括如下步骤：