[发明专利]一种稳定构建表达突变型SHP2重组细胞株的方法

权利要求书

1.一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株，其特征在于，该重组细胞株表达突变型SHP2蛋白，所述突变型SHP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

2.权利要求1所述的一种稳定表达突变型SHP2的重组细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID No.1所示的SHP2(T507K)基因克隆到慢病毒载体上；

(2)将步骤(1)得到的慢病毒载体转染293T细胞包装成病毒；

(3)将步骤(2)得到的病毒感染细胞，筛选阳性后传代，建立稳定表达突变型SHP2蛋白的细胞株。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将绿色荧光蛋白EGFP连接至高拷贝质粒载体pCDH-3HA-Puro上，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒；将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示SHP2(T507K)连接至载体pCDH-3HA-Puro-EGFP，并转化感受态大肠杆菌；将转化后的大肠杆菌进行质粒提取，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒；

(2)利用PEI转染试剂将pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)、psPAX2和pMD2G质粒转染进293T细胞中，然后将转染后的293T细胞扩大培养；转染24h后的收集病毒上清液；采用超速离心的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，将病毒加入待建立稳转表达的细胞中。

(3)利用Puromycin筛选细胞，获得阳性表达率高的细胞群；通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，或利用流式分选，选择绿色荧光表达强的细胞克隆，继续扩大培养，直至获得稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株；通过Western-bolt实验，利用HA抗体进一步对细胞株进行鉴定。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体方法为：

1a)用Taq DNA聚合酶分别对EGFP及质粒载体pCDH-3HA-Puro进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；

1b)将回收后的EGFP、pCDH-3HA-Puro、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物；

1c)将步骤1b)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP重组产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP质粒；

1d)用Taq DNA聚合酶分别对pCDH-3HA-Puro-EGFP及SHP2 cDNA进行PCR扩增，对扩增后的所得产物进行电泳以及切胶回收，得到胶回收产物；

1e)将回收后的pCDH-3HA-Puro-EGFP、SHP2、同源重组酶以及缓冲液混合均匀进行重组反应得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物；

1f)将步骤1e)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2重组产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2质粒。

1g)用Q5点突变试剂盒以pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2为模板进行点突变，对所得产物进行电泳以及切胶回收，得到pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物；

1h)将步骤1g)所得的pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)胶回收产物转化至感受态大肠杆菌中，涂布接种至含氨苄青霉素的平板上，37℃隔夜培养，挑选单克隆菌落，经测序验证后，获得pCDH-3HA-Puro-EGFP-SHP2(T507K)质粒。