[发明专利]融合蛋白合成的方法和产品

说明书

本发明提供了生产融合蛋白的方法，所述方法包括：a)将第一蛋白质与第二蛋白质在能够在所述蛋白质之间形成异肽键的条件下接触，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质每种包括肽连接体，其中所述肽连接体是肽连接体对，其反应以形成连接所述第一蛋白质至所述第二蛋白质以形成连接的蛋白质的异肽键；和b)将来自(a)的所述连接的蛋白质与第三蛋白质在能够在所述第三蛋白质和所述连接的蛋白质之间形成异肽键的条件下接触，其中所述第三蛋白质包括与来自(a)的连接的蛋白质中的进一步肽连接体反应的肽连接体，并且其中所述肽连接体是肽连接体对，其反应以形成连接所述第三蛋白质至所述连接的蛋白质以形成融合蛋白的异肽键，其中在(a)中使用的所述肽连接体对正交于在(b)中使用的肽连接体对。也提供了肽连接体和正交的所述连接体对在合成融合蛋白中的用途。也考虑包括所述连接体的重组蛋白、编码所述蛋白质和连接体的核酸分子、包括所述核酸分子的载体和包括所述载体和核酸分子的宿主细胞。

本申请是申请日2016年6月3日、申请号201680037511.8、发明名称为“融合蛋白合成的方法和产品”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及融合蛋白(即包括两种或更多种共价连接的蛋白质的聚合物，如下面所定义的)的合成(即生产、生成或装配)，并且具体地涉及使用反应以形成异肽键的正交的肽连接体对模块式(例如逐步)合成融合蛋白。本发明涉及提供用于合成融合蛋白——具体而言固相合成——的新方法。该方法可以有利地用于生产多种产品，包括融合蛋白，例如融合蛋白阵列。本发明也提供了肽连接体和正交的所述连接体对在合成融合蛋白中的用途。也提供了包括所述连接体的重组蛋白、编码所述蛋白和连接体的核酸分子、包括所述核酸分子的载体和包括所述载体和核酸分子的宿主细胞。也提供了包括所述重组多肽和/或核酸分子/载体的试剂盒。也考虑由本发明的方法获得的融合蛋白和包括所述融合蛋白的产品，例如阵列和文库。

背景技术

生物学事件通常取决于多种蛋白质的协同活性并且复合体中蛋白质的精确排列影响和决定它们的功能。因而，以受控方式排列复合体中单独蛋白质的能力代表表征蛋白质功能中的有用工具。而且，缀合多种蛋白质以形成所谓的“融合蛋白”可以导致具有有用特征的分子。例如，簇集单一种类的蛋白质通常大大地增强了生物学信号，例如疫苗上的重复抗原结构。具有不同活性的簇集蛋白也可以导致具有改善活性的复合体，例如通过酶的底物引导(substrate channelling)。

但是，簇集不同种类的蛋白质成为精确的人造“融合蛋白”已经遇到了许多问题。例如，单独蛋白质或蛋白结构域可以基因地接合为一个长的开放阅读框，但是蛋白质合成中的错误和错折叠很快成为限制。可选方法已经集中于单独地表达蛋白质或蛋白结构域并且然后将这些“模块”或“单元”连接在一起。例如，方法已经集中于修饰蛋白质以包含良好表征的相互作用配偶体，比如生物素/抗生物素蛋白，从而使得蛋白质能够通过非共价相互作用形成复合体。其它方法依赖于蛋白质内的反应基团——具体而言半胱氨酸残基——以通过共价键即二硫键连接蛋白质。但是，即使最佳的非共价键或可逆共价键允许融合蛋白的重排。因此，现有方法是受限的，因为它们通常导致难以分离的融合蛋白的不明确的混合物和/或在多种环境下例如在还原条件下不稳定的融合蛋白。

用于合成融合蛋白的系统的重要特征包括独立于任何模板的所述融合蛋白内的单独蛋白(即模块、结构域或单元)与每种蛋白(即模块、结构域或单元)的简单表达之间的分子上限定的连接。对于每种反应具有近乎定量的产率从而最小化几个步骤之后的非均质(heterogeneous)产品的无意合成——其是混合物内不完整链的常见结果——也是高度期望的。对于单独模块也优选地是利用相对小的肽标记物而不是大的蛋白融合结构域进行修饰，以便于最小化对融合蛋白内的每种模块功能的破坏。但是，现有融合蛋白合成方法尚不能够满足这些标准。

因而，对于用于合成融合蛋白的改善方法存在需要和期望，并且现在已经发现了形成异肽键以生成不可逆共价键的肽连接体可以被用在用于合成融合蛋白的模块式(例如逐步)和高产率方法中。