[发明专利]一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法

说明书

本发明提供了一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，针对使用过并吸附了血液高丰度蛋白的免疫亲和柱，先采用含有尿素的甘氨酸‑盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸‑盐酸溶液洗脱3次，再经中和溶液调节pH至中性，经平衡溶液使免疫亲和柱保持稳定状态，并在保存溶液中可以长期保存。该方法操作简单，所用试剂低毒环保，再生后的免疫亲和柱可重复使用20次以上，显著减少了实验成本。

技术领域

本发明属于免疫亲和柱技术领域，涉及一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法。

背景技术

人体血液中蛋白质多达20000余种，对血液中蛋白质含量变化的检测可以反映出机体的健康状态以及疾病或药物暴露对机体的影响。但是，血液中的蛋白质浓度差异很大，变化范围达10个数量级，其中包括白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、载脂蛋白在内的14种高丰度蛋白占血液中蛋白总量的95％以上，而且大多数与疾病状态相关的蛋白生物标志物在血液中的含量很低，大部分仅处于ng/mL和pg/mL的水平，检测信号容易被高丰度蛋白掩盖。为了增加血液中低丰度蛋白的检出率，在蛋白质组学研究中通常采用免疫亲和柱去除血液样本中的高丰度蛋白。

免疫亲和柱通过偶联多种高丰度蛋白抗体的固定化配基与目标高丰度蛋白的免疫结合作用，将目标高丰度蛋白进行去除，一次可去除血液样本中95％以上的高丰度蛋白，并且去除过程具有高度的专一性和选择性，能够保留绝大多数的低丰度蛋白。

但是目前商品化的免疫亲和柱价格昂贵，以Thermo Scientific品牌的Top14Abundant Protein Depletion Midi Spin Columns(货号A36371)为例，单根的采购成本高达700元以上，并且免疫亲和柱为一次性使用，导致大批量样品处理成本过高，极大地限制了蛋白质组学研究工作的开展。

因此急需找到一种能使商品化血液高丰度蛋白免疫亲和柱再生，可以重复使用的方法，从而降低实验成本。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，针对使用过并吸附了血液高丰度蛋白的免疫亲和柱，先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液洗脱3次，再经中和溶液中和pH，经平衡溶液使免疫亲和柱保持稳定状态，并在保存溶液中可以长期保存。该方法操作简单，所用试剂低毒环保，再生后的免疫亲和柱可重复使用20次以上，显著减少了实验成本。

一方面，本发明提供了一种血液高丰度蛋白免疫亲和柱的再生方法，所述方法主要先采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，再采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液进行洗脱。

本发明所述的血液高丰度蛋白为：人血清白蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G、免疫球蛋白G(轻链)、免疫球蛋白M、α-1-酸性糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白A1、纤维蛋白原、触珠蛋白和转铁蛋白共计14种蛋白。

用于去除血液中这14种高丰度蛋白的免疫亲和柱，为Thermo Scientific品牌的Top14Abundant Protein Depletion Midi Spin Columns(货号A36371)，通过柱体中树脂填料上键合的高度特异性的固定化抗体去除血液样本中对应的高丰度蛋白，也就是说免疫亲和柱中键合有这14种蛋白的抗体，能够特异性吸附血液中的这14种蛋白。

本发明提供的使血液高丰度蛋白免疫亲和柱再生的洗脱方法，是采用两步较温和的酸性洗脱，第一步为采用含有尿素的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，尿素可以使蛋白变性，使蛋白从抗体上解离下来，从而增加洗脱液的洗脱能力；第二步为采用含有氯化钠的甘氨酸-盐酸溶液洗脱，氯化钠可以改变溶液的离子强度，降低抗原-抗体的结合作用，也可以提高洗脱效率。