[发明专利]一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法

说明书

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，特别涉及一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，步骤包括茎的切割处理，外植体的诱导、继代培育，愈伤组织的分化培养和丛生芽的生根培养。本发明旨在以白花前胡的茎为外植体，提供建立愈伤诱导、愈伤分化、丛生苗生根等再生体系的详细过程与方法。

技术领域

本发明属于植物组织培养快速繁殖技术领域，特别涉及一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法。

背景技术

由于长期的人工栽培导致前胡种资源退化、前胡根部从之前的单根转变为较多分叉的多根，不仅品质下降还难以切割形成饮片。种子繁殖萌发率低，出苗不整齐，生长周期长。另外，前胡栽培品种一般次年就出现抽薹现象，这些问题严重制约了前胡的可持续发展，既难满足中草药市场需求，又增大了种植成本。利用植物组织培养技术可以保持母本的优良性状，避免遗传变异和种性退化，高繁殖率为前胡工厂化育苗提供可能。

现有研究均认为白花前胡的叶片最适合作为快速繁育的部位，例如“《宁前胡愈伤组织诱导初探》，吴沿胜等，种子，2017年第9期”中就对白花前胡的根、茎、叶在不同激素组合下的诱导情况进行了公开，最终得出结论为“白花前胡叶片的诱导效果最好，其次分别是茎段和根”。然而，通过实验重现发现叶的实际诱导效果并不好、远远低于茎的诱导效果，随后经过分析发现了叶作为外植体的明显缺陷：由于放入培养基中的叶需要切成0.25cm²大小，培养时叶的边沿容易翘起，一方面叶自身厚度较薄，边沿创口处的水分容易丧失，另一方面叶翘起离开培养基表面，进而影响边沿创口的愈伤诱导，导致的结果是叶片很容易丧失水分变干、如果不时刻注意进行补水则叶片诱导形成愈伤组织的成功率非常低，但进行补水会改变培养基的成分浓度导致数据不准且培养步骤复杂。相比之下，茎呈杆状、很容易贴合培养基表面，既利于保持本身组织水分又利于营养吸收，整个快速繁育过程中都不需要补水，茎的培养难度明显低于叶片、更适合工厂化育苗。

因此，本发明旨在以白花前胡的茎为外植体，提供建立愈伤诱导、愈伤分化、丛生苗生根等再生体系的详细过程与方法。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用白花前胡的茎建立高效再生体系的方法，包括以下步骤：

步骤1.茎的切割处理：选出白花前胡的茎，消毒后切成长度1.0cm的茎段，在茎段外切割2～4条纵向的创口，所述创口整体均匀环绕着茎段切割；每条创口的深度大于茎表皮的厚度，每条创口的深度小于茎段直径的三分之一，每条创口的长度小于茎段长度的四分之一；

步骤2.诱导、继代培育：将经过步骤1切割处理后的茎段放入愈伤组织诱导培养基，所述愈伤组织诱导培养基为1/2MS+NAA0.4mg/L+TDZ 0.1mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖35g/L，光照条件为黑暗或弱光，培养3周后进行继代培养，继代培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，光照条件为黑暗或弱光，继代培养时间为1～2周，得到白花前胡愈伤组织；

步骤3.分化培养：将经过步骤2培养形成的愈伤组织切分为0.5cm³的小方块，再接种到分化培养基，所述分化培养基为1/2MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3.5g/L+蔗糖40g/L，光照条件为时长为12h/d，培养时间为4～5周，得到白花前胡丛生芽；

步骤4.生根培养：将经过步骤3培养形成的丛生芽的芽苗长至2-3cm时、从基部切下成为单芽，再接种到生根培养基，所述生根培养基为1/2MS+NAA0.2 mg/L+植物凝胶3g/L+蔗糖40g/L，光照条件为时长为12h/d，培养时间为5～6周，得到生根的白花前胡无菌组培苗。

而且，步骤1中消毒是先用75％乙醇消毒10min、无菌水冲洗3～5次，再用8％次氯酸钠消毒15min、无菌水冲洗3～5次。