[发明专利]一种用于病原微生物的检测方法及可视化荧光检测装置

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于病原微生物的检测方法及可视化荧光检测装置。本发明通过设计发射固定架与底座连接且发射固定架与接收固定架连接，形成密闭的光通道，使得激发灯发出的激光光源沿两个固定架的轴向进行传播，有利于减少光束的发散，亮度提高。本发明通过设计固定孔，有助于反应管的随时放入与取出，样品检测操作方便简单，随用随测，灵活性显著提高。本发明通过设置发射滤光片以及接收滤光片，有效滤除混杂的其他波长的激光。有助于操作人员通过观察孔直接肉眼观察即可获得即时荧光检测结果，检测快速高效省时，操作简单。本发明的荧光实时检测装置体积小巧便携，适合现场即时检测，成本低，有利于在生产实践中推广应用。

技术领域

本申请主张2022年11月16日申请的中国专利申请2022230425157和中国专利申请2022114330904的优先权，上述说明书的全部内容为本申请的参考文献。

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于病原微生物的检测方法及可视化荧光检测装置。

背景技术

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性短杆菌，在肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品和蔬菜中均可能存在。它能引起人类和动物的李氏菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。2000年，世界卫生组织(WHO)将其列为需要重点监测的食源性致病菌之一。在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

目前，国内外对于单核细胞增生李斯特菌的检测主要还是培养法、血清学的检测方法、基于PCR等核酸扩增的检查方法。PCR反应也称之为聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，因其具有特异性强、灵敏度高等特点被广泛应用。在进行PCR反应操作时，需要进行实时荧光检测。而进行实时荧光检测操作时，需要用到对应的实时荧光检测装置。目前市面上常见的实时荧光定量PCR仪主要是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号值的积累从而对反应产物进行定量分析。但是PCR仪通常体积较大，不够便携，不适合现场即时检测且需要一定的专业操作人员。因此，为了确保食品安全，亟需快速省时、操作简便、准确的方法来检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。

CRISPR/Cas系统由成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)和它的辅助蛋白(CRISPR associatedproteins，Cas)构成，是一种细菌适应性免疫系统。CRISPR/Cas12a为V型CRISPR/Cas系统，是一种由crRNA引导的具有DNA酶活性的蛋白质，可以特异性地结合和切割dsDNA或ssDNA。此外，被特异性dsDNA、ssDNA激活后的Cas12a还具有非特异性ssDNA切割酶活性。CRISPR/Cas12a的精准靶向性，为其应用于核酸检测奠定了基础。Cas12a后续激活的ssDNA非特异性切割活性为其进行检测信号的放大和可视化读取提供了有利依据。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的实时荧光定量PCR仪不够便携、不适合现场即时检测、操作复杂、费时且成本高的缺陷，提供了一种用于病原微生物的检测方法及可视化荧光检测装置。