[发明专利]一种用于病原微生物的检测方法及可视化荧光检测装置

权利要求书

1.一种可视化荧光检测装置，其特征在于，包括：

底座（1），其上设置有用于发出激光的激发灯（2）；

发射固定架（3），其一端盖设在激发灯（2）上且与底座（1）固定连接，其内部设置有发射滤光片（4），从而使得激发灯（2）发出的激光经过过滤得到发射光；

接收固定架（5），其一端与发射固定架（3）的另一端固定连接，发射固定架（3）与接收固定架（5）的连接处设置有用于容纳反应管（6）的固定孔（7）；

所述接收固定架（5）的内部设置有接收滤光片（8），从而使得发射光与反应管（6）内部产物被发射光激发出的荧光混合后得到的混合光经过过滤得到接收光；

所述接收固定架（5）的另一端设置有用于观察反应管（6）内产物颜色变化的观察孔（9）。

2.根据权利要求1所述的一种可视化荧光检测装置，其特征在于，所述发射固定架（3）与接收固定架（5）连接处形成的夹角为钝角。

3.根据权利要求1所述的一种可视化荧光检测装置，其特征在于，所述接收滤光片（8）滤过的接收光的波长大于发射滤光片（4）滤过的发射光的波长。

4.根据权利要求1所述的一种可视化荧光检测装置，其特征在于，所述发射滤光片（4）位于激发灯（2）上方且靠近底座（1），所述接收滤光片（8）靠近观察孔（9）一侧。

5.根据权利要求4所述的一种可视化荧光检测装置，其特征在于，所述底座（1）上还设置有用于控制激发灯（2）开闭的开关（10）。

6.一种如权利要求1~5中任意一项所述的可视化荧光检测装置在检测病原微生物中的应用。

7.一种用于病原微生物的荧光检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（S.1）对不同病原微生物菌株的基因组序列，设计靶点特异性的crRNA序列，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

（S.2）对步骤（S.1）中的病原微生物菌株的靶点设计LAMP扩增引物，引物序列如序列表中SEQ ID NO:1~4所示，对待测核酸样品进行LAMP反应，获得LAMP扩增产物溶液；

（S.3）将步骤（S.1）中纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、步骤（S.2）中获得的LAMP扩增产物溶液与Cas12a、单链DNA探针在CRISPR反应体系中混合，进行反应，得到CRISPR反应产物；

（S.4）将装有步骤（S.3）中得到的CRISPR反应产物的反应管（6）置于如权利要求1~5中任意一项所述的可视化荧光检测装置的固定孔（7）中，打开激发灯（2）通过观察孔（9）进行观察CRISPR反应产物颜色变化，即可获得荧光检测结果。

8.根据权利要求7所述的一种用于病原微生物的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中的单链DNA探针序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

9.根据权利要求7所述的一种用于病原微生物的即时荧光检测方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中的CRISPR反应体系为20μL体系中，0.05~0.2μM Cas12a，0.25~1μM crRNA，1~4μM 单链DNA探针，0.4U 重组RNA酶抑制剂，1~3μL LAMP扩增产物溶液，1×NEB buffer 2.1，其中，Cas12a与crRNA的摩尔比为1:5。

10.根据权利要求7所述的一种用于病原微生物的即时荧光检测方法，其特征在于，所述步骤（S.1）中的病原微生物为单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、DNA病毒中的任意一种。