[发明专利]fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用

说明书

本发明公开了fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列。所述基因组序列经过人工改造，包括：将fiber2的knob编码序列替换为CELO病毒fiber1的knob编码序列；在外源基因表达框启动子上游和目的基因编码区下游分别添加一个限制性内切酶SwaI酶切位点。本发明改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞和禽类细胞的基因转导效率，可以用于制备哺乳动物的重组疫苗或基因治疗试剂盒，也可以用于制备禽类的重组疫苗。

技术领域

本发明属于基因治疗和重组疫苗领域，具体而言，本发明涉及fiber假型禽4型腺病毒载体及其应用。

背景技术

腺病毒是一类非包膜病毒，其病毒粒子包裹长度为26-48 kb的线性双链DNA基因组。腺病毒科由6个属组成，其中哺乳动物腺病毒仅感染哺乳动物宿主，而鸟腺病毒仅发现于鸟类^[1]。人类腺病毒（HAdV），特别是人5型腺病毒（HAdV-5），已得到深入研究。腺病毒已从人，黑猩猩，猴，牛，羊，猪，狗，小鼠和其他哺乳动物中分离到，其中一些已被构建为基因转移载体。与其他病毒载体相比，腺病毒载体具有一些特征，其基因组稳定且便于遗传操作，可规模化生产和纯化，基因转移效率高，具有遗传安全性^{[2, 3]}。腺病毒载体已被广泛用于基因治疗和疫苗开发^{[2, 4]}。

预存免疫是腺病毒载体在人类基因治疗和疫苗接种中应用的主要障碍^{[5, 6]}。腺病毒是在人类广泛传播的病原体，成人中HAdV-5血清中和抗体阳性率高达50-90%，这降低了HAdV-5载体疫苗的免疫效果^{[7, 8]}。为了克服这一障碍，构建基于罕见血清型、非人类腺病毒甚至禽腺病毒载体的研究增多^[9-13]。

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）归类于鸟腺病毒属。禽腺病毒基因组大小为43-46kb，比哺乳动物腺病毒长7-10kb。禽腺病毒基因组中部是属共有基因，表达病毒结构蛋白、病毒基因组复制酶或者参与病毒颗粒组装的蛋白质，在整个腺病毒科中都相对保守；属特异基因位于基因组左右两侧，其表达产物主要参与病毒与宿主的相互作用，为病毒复制营造适宜的细胞内环境。FAdV的属特异基因与哺乳动物腺病毒没有同源性，这使得FAdV无法在哺乳动物细胞复制。最近的研究结果表明，单个属特异基因对于禽4型腺病毒（FAdV-4）在体外复制都不是必需的^[14]。FAdV的上述特性使得FAdV载体与哺乳动物腺病毒载体具有互补性。

禽4型腺病毒（FAdV-4）的基因组已经得到克隆，并以其为基础构建了FAdV-4载体系统^{[15, 16]}。与现有腺病毒载体相比，FAdV-4载体可能优势和潜力表现在：外源基因载量大；其与哺乳动物腺病毒亲缘关系远，不能在哺乳动物细胞复制，安全性更高；作为哺乳动物基因转移载体时，FAdV-4自身基因的表达水平会更低，这将有利于延长目的基因的表达时间。此外，FAdV-4还可以用作禽类传染病的疫苗载体。野生型FAdV-4能够在肉鸡引发肝炎-心包积水综合征，主要通过粪口途径在鸡群传播，以其作为载体，可以制备其他禽病（例如禽流感、新城疫、传染性法氏囊病等）的载体疫苗，将可以同时预防鸡引发肝炎-心包积水综合征。同时，FAdV物理性质更稳定，可以用鸡胚扩增，因而载体的制备成本更低。如果采用口服途径免疫，将进一步减小病毒纯化、接种器材和人力成本。