[发明专利]一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括磁微粒试剂、标记的鼠抗人IgE抗体试剂、酶结合物试剂、发光底物液、质控品、校准品以及清洗液；所述磁微粒试剂含有包被有多聚过敏原的磁微粒，所述标记的鼠抗人IgE抗体试剂含有标记的鼠抗人IgE抗体，所述发光底物液包括底物A液和底物B液；所述标记的鼠抗人IgE抗体为标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体；所述亲水聚合物为聚乙烯亚胺、九聚精氨酸中的一种；所述标记的被亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体的标记物为生物素，且所述酶结合物试剂为辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂；所述包被有多聚过敏原的磁微粒为包被有多聚过敏原的甲苯磺酰基磁微粒；

上述过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

S1、磁微粒试剂的制备

S11、将过敏原加入到离心管中，并使用0.1mol/L包被缓冲液进行稀释；将Pierce™Traut试剂使用0.1mol/L包被缓冲液进行溶解，并涡旋混匀；将溶解混匀的Pierce™ Traut试剂与稀释后的过敏原一起混合均匀，并在室温条件下反应0.5小时，反应结束后，即得到多聚过敏原；将多聚过敏原进行超滤，超滤结束后，即得到经过纯化的多聚过敏原；

S12、将甲苯磺酰基磁微粒和0.1mol/L包被缓冲液加入到离心管中，并涡旋混匀；混匀后，将离心管进行超声，超声结束后，进行磁分离，并舍弃上清液；再次加入0.1mol/L包被缓冲液，并涡旋混匀，然后进行磁分离，并舍弃上清液；

S13、在S12所得到的磁微粒溶液中，加入0.1mol/L包被缓冲液，并涡旋混匀；混匀后，加入S11所得到的多聚过敏原，并加入1.3mol/L增强剂，搅拌混匀反应24小时；

S14、在S13所得到的磁微粒溶液中，加入1.5mol/L封闭剂，并且搅拌混匀8小时；

S15、对S14所得到的磁微粒溶液进行磁分离，并舍弃上清液，然后，使用磁微粒稀释液重悬磁微粒，稀释结束后，即得到包被有多聚过敏原的磁微粒试剂，磁微粒试剂于2～8℃保存；

S2、生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂的制备

S21、将鼠抗人IgE抗体和0.1mol/L活化缓冲液加入到离心管中，并向离心管中加入亲水聚合物，于室温条件下涡旋混匀10分钟；将EDC使用0.1mol/L活化缓冲液进行溶解，并涡旋混匀；将溶解混匀的EDC溶液加入到离心管中，于室温条件下使鼠抗人IgE抗体、亲水聚合物和EDC一起涡旋混匀反应45分钟，反应结束后，即得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体；

S22、将S21所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体进行超滤；超滤结束后，将亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体回收至离心管中，并向离心管中加入0.02mol/L的PBS缓冲液，得到亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液；

S23、将生物素加入到离心管中，并向离心管中加入纯化水至终浓度为10㎎/mL，然后，涡旋混匀，得到生物素溶液；

S24、将生物素溶液与S22所得到的亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体溶液进行涡旋混匀，并于室温静置反应0.5小时，得到标记产物；

S25、将S24中所得到的标记产物吸取至透析袋中，并使用0.02mol/L的PBS缓冲液在2～8℃进行过夜透析；

S26、将透析完毕的标记产物吸取至离心管中，在离心管中加入与标记产物等体积的甘油，并涡旋混匀，即得到生物素标记亲水聚合物修饰的鼠抗人IgE抗体试剂；

S3、辣根过氧化物酶标记亲和素试剂的制备

S31、将辣根过氧化物酶加入到离心管中，并向离心管中加入纯化水进行溶解并使得终浓度为20㎎/mL，即得到辣根过氧化物酶溶液；

S32、在离心管中加入20㎎/mL辣根过氧化物酶溶液和22mmol/L高碘酸钠溶液，于2～8℃条件下反应1小时，即得到辣根过氧化物酶活化产物；并将辣根过氧化物酶活化产物进行超滤；

S33、将亲和素与S32超滤完毕的辣根过氧化物酶活化产物进行混合，于2～8℃且避光条件下反应2小时；反应结束后，加入0.26mol/L硼氢化钠溶液，于2～8℃且避光条件下反应0.5小时，即得到辣根过氧化物酶标记亲和素溶液；

S34、在S33所得到的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，于2～8℃条件下静置0.5小时；然后进行离心，并舍弃上清液；再然后，使用0.02mol/L的PBS缓冲液溶解沉淀，即得到经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液；

S35、在离心管中加入S34所得到的经过纯化的辣根过氧化物酶标记亲和素溶液，并加入甘油，然后涡旋混匀，即得到辣根过氧化物酶标记亲和素试剂；

S4、发光底物液的制备

S41、底物A液的配制

将0.61%三羟甲基氨基甲烷、0.35%鲁米诺钠盐以及0.02%对碘苯酚通过使用纯化水进行搅拌直至溶解；调节溶液pH值为9.0，并定容至1000mL，即得到底物A液；

S42、底物B液的配制

将0.61%三羟甲基氨基甲烷、0.01%硫代硫酸钠以及0.02%过氧化脲通过使用纯化水进行搅拌直至溶解，然后加入0.05%吐温-20进行搅拌直至溶解；调节溶液pH值为8.5，并定容至1000mL，即得到底物B液；

S5、清洗液的制备

将0.29%十二水合磷酸氢二钠、0.03%二水合磷酸二氢钠以及0.85%氯化钠通过使用纯化水进行搅拌直至溶解；然后加入0.05%吐温-20和0.05% Proclin 300进行搅拌直至溶解；并定容至1000mL，即得到清洗液；

S6、校准品的制备和质控品的制备

S61、校准品与质控品稀释液的配制

将0.29%十二水合磷酸氢二钠、0.026%磷酸二氢钾、0.02%氯化钾以及0.8%氯化钠通过使用纯化水进行搅拌直至溶解；然后加入0.5%吐温-20和0.05% Proclin 300进行搅拌直至溶解；并定容至1000mL，即得到校准品与质控品稀释液；

S62、校准品的配制

取人IgE抗体，通过使用校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.05、0.35、2、10、40、100 IU/mL的校准品；

S63、质控品的配制

取人IgE抗体，通过使用校准品与质控品稀释液配制成浓度分别为0.35、20 IU/mL的质控品。