[发明专利]重组人粒细胞集落刺激因子的高压定点聚乙二醇修饰方法

说明书

本发明提供重组人粒细胞集落刺激因子的高压定点聚乙二醇修饰方法，通过对rhG‑CSF和马来酰亚胺聚乙二醇修饰试剂的混合溶液在0.1‑600MPa压力下反应6‑24h；对修饰后的产物进行分离纯化并进行结构和活性验证。本发明方法能提高rhG‑CSF修饰反应效率，使用mPEG‑40kDa‑MAL和mPEG‑20kDa‑MAL定点修饰rhG‑CSF时分别能够提升蛋白单修饰率达到32％和45％，而常压下几乎不发生修饰反应，还能够减弱常规修饰反应参数的影响，提升生产效率，降低生产成本，适用于大规模工业生产。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的高压定点聚乙二醇修饰方法。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF)主要是由巨噬细胞、内皮细胞及成纤维母细胞产生的一种造血因子，于1980s年代初被发现，随后科研人员将人粒细胞集落刺激因子进行重组表达，成功制备出rhG-CSF。1991年美国FDA批准通过了Amgen公司重组粒细胞集落刺激因子Neupogen的申请，随后正式投放市场并获得了良好的销售成绩。重组人粒细胞集落刺激因子可以用于治疗各种原因引起的粒细胞减少症，临床上主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞减少症、治疗伴随发热的中性粒细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍和骨髓增生异常综合征、预防白细胞减少可能潜在的感染并发症、使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快以及用于外周干细胞动员、AIDS的辅助治疗和肝、肾移植后中性粒细胞的恢复等。但是通过重组原核表达得到的rhG-CSF因为缺少翻译后修饰过程，存在半衰期短、免疫原性强等问题，是临床病人药物治疗的一大难题。

蛋白药物的聚乙二醇修饰已被证明具有改善药物稳定性、提高药物溶解性、降低药物免疫原性、提高抗酶解能力以及有效延长药物半衰期等特点。至今已有数十种聚乙二醇修饰药物通过FDA批准上市或处于不同临床研究阶段，并且都具有优异的临床医疗效果，同时也表现出良好的业绩(Turecek et al.,2016)。进一步通过蛋白定点修饰技术则可以解决聚乙二醇修饰过程中存在的修饰产物不均一，修饰样品活性降低以及修饰效率低等问题，其中使用马来酰亚胺修饰试剂与蛋白游离巯基进行定点修饰反应具有特异性高和反应活性强的特点(Boutureira and Bernardes,2015；Jevsevar et al.,2010)。rhG-CSF分子中有五个Cys残基，Cys36-Cys42和Cys64-Cys74形成了两对二硫键，其作用在于维系分子的高级结构并保持其生物学活性，Cys17则以游离巯基的形式存在。研究人员发现使用马来酰亚胺修饰试剂与rhG-CSF游离巯基进行定点修饰反应时存在修饰效率低的问题。这是因为通常情况下，在蛋白折叠过程中，表面的游离半胱氨酸残基倾向于被包埋在疏水区域中，从而防止形成蛋白链间二硫键错配聚集体(Pfister and Morbidelli,2014)。而蛋白表面形成的疏水区域会阻止亲水性物质如PEG等的进入。在这种情况下，PEG修饰试剂很难与巯基接触并反应，因此修饰反应效率较低。

在定点修饰反应过程中，PEG修饰试剂与蛋白修饰位点之间的空间可及性影响整个修饰反应过程。PEG分子量大小以及被修饰基团的位置对修饰反应速率以及修饰率有显著影响，这是由于空间位阻的存在影响了整个修饰反应效率(Pfister et al.,2015；Pasutand Veronese,2012)。因此提升蛋白被修饰位点的暴露程度从而提升整个修饰反应效率成为一种解决办法。通过使用可逆变性的修饰策略对rhG-CSF蛋白进行巯基定点修饰能够提升rhG-CSF的修饰率，但是在修饰蛋白样品中发现大量聚集体，修饰成本较高(Veronese etal.,2007)。这是因为rhG-CSF自身具有较强的疏水性，变性情况下rhG-CSF蛋白的疏水基团完全暴露，相互之间聚集产生沉淀(Roessl et al.,2012；Monahan et al.,1995)。

因此，在本领域中，需要寻找一种高效便捷并且相对较低成本的rhG-CSF定点马来酰亚胺聚乙二醇的修饰方法。

发明内容