[发明专利]一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法

权利要求书

1.一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

S1、猪骨骼肌肌纤维图像采集

(1)猪骨骼肌肌肉样品采集；

(2)骨骼肌石蜡切片制备；

(3)石蜡切片的HE染色；

(4)图像采集；

S2、利用Image J软件对S1的图像进行定量分析处理；

S3、肌纤维直径的计算

肌纤维的横切面积S1为选定区域内肌纤维总面积S0除以选定范围内肌纤维的数目N，即S1＝S0/N；

肌纤维直径

计算多个选定区域(n)中肌纤维的平均直径d1，d2，d3……dn；得到该个体的平均肌纤维直径d＝(d1+d2+d3+……+dn)/n。

2.根据权利要求1所述的一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法，其特征在于，步骤S3进行手动选择肌纤维测定区域及肌纤维测定区域内肌纤维计数，保证经过多个区域测定后，肌纤维直径的总根数大于150根。

3.根据权利要求1所述的一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法，其特征在于，步骤S2中Image J软件处理操作为：

(1)将使用显微成像系统拍摄的放大200倍的高清图片导出到电脑中，使用Image J软件打开需处理的肌纤维照片；

(2)利用软件Set Scale工具设定标尺参数，将图片本身的像素点与实际长度匹配，得到图片的实际微米(μm)长度；

(3)利用软件type工具将图片类型转为8-bit格式的灰度图；

(4)利用软件adjust-Threshold工具调整图像阈值，应用后图像转化为二值图，此时肌纤维呈现黑色，肌纤维间的背景为白色；

(5)利用软件填充工具将肌纤维因制作切片过程中因肌肉失水形成的肌纤维内部网孔填充至黑色；

(6)利用手动选择工具选定图片内的肌纤维区域，剔除不完整的肌纤维；

(7)利用测量工具，测量手动选择区域内黑色区域的面积，即得到肌纤维的总面积S0(μm²)；

(8)利用Cell Counter工具统计选定范围内肌纤维的数目N根，带入肌纤维直径计算公式并进一步计算得个体的平均肌纤维直径，保证多个选定范围内肌纤维数总数大于150根。

4.根据权利要求1所述的一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法，其特征在于，步骤S1中(1)猪骨骼肌肌肉样品采集，是猪屠宰后，取需检测部位骨骼肌组织，剔除外周肌膜、肌腱、筋膜、脂肪组织后，顺着肌纤维方向取1cm×1cm×2cm(长×宽×高)的肉块，迅速放在4％多聚甲醛固定液中固定；

步骤S1中(2)骨骼肌石蜡切片制备，是将骨骼肌样本固定24h以上，切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的组织块，放入脱水盒内脱水，然后进行组织透明、浸蜡、包埋、冷却并修整蜡块，最后切成4μm厚的切片，组织展平后捞起，烤片、常温保存备用；

步骤S1中(3)是对切片脱蜡后进行HE染色处理；

步骤S1中(4)图像采集时，为肌纤维图像添加标尺，猪纤维直径测量选择200倍放大倍数。

5.根据权利要求4所述的一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法，其特征在于，步骤S1中(4)图像采集的操作，利用显微镜镜检，通过成像系统进行图像采集。

6.根据权利要求4所述的一种基于Image J图像分析的猪肌纤维直径测定方法，其特征在于，HE染色处理包括以下操作：

将切片放入苏木素染液染3～5min对细胞核进行染色，移入水中洗去染液和浮色；而后将切片放入苏木素分化液中分化2～5s，去除组织中过多结合及非特异性吸附的染料，移入流水中充分洗涤；放入苏木素返蓝液2～5s，使苏木素呈现蓝色，移入流水中充分洗涤；将切片依次入85％和95％的酒精脱水各5min后，放入伊红染液中染色5～8min，保证肌纤维被染成较深的桃红色；将切片依次放入无水乙醇I 5min、无水乙醇II 5min、无水乙醇Ⅲ5min、二甲Ⅰ5min、二甲苯Ⅱ5min进行透明，并用中性树胶封片。